免疫印迹膜剥离和重新检测

免疫印迹是研究蛋白质功能和定位的常用技术。通常,蛋白质样品可在SDS-PAGE上分离并转印至硝酸纤维素膜PVDF膜上,然后用特异性抗体进行检测。与可重复利用Southern和Northern印迹的核酸技术不同,免疫印迹很难重复使用。

 

免疫印迹的剥离和重新检测技术具有以下几个优点:

  1. 保护昂贵或限量供应的样品,
  2. 指定印迹分析可使用几种不同抗体,如亚型或同种型特异性抗体,
  3. 使用相同或不同的抗体重新分析异常结果并确认,
  4. 纠正使用错误的抗体孵育而产生的错误结果,
  5. 重复使用相同印迹可节省试剂和时间。

目前已经公布了几种用于从免疫印迹上剥离抗体的方案,包括低pH1,2、加热和去垢剂3,4以及离液剂5等方法。以下是三种推荐方案。第一种方案适用于任何化学发光底物系统,即通过加热和去垢剂的组合来解离抗体。第二种常用于抗体必须与抗原分离的应用,即采用低pH值来改变抗体的结构,使结合位点失活。

第三种方案利用具有特殊配方的ReBlot™ Plus Western Blot Recycling Kit(抗体剥离试剂盒)从免疫印迹膜上剥离抗体。该方法的优势在于:

  • 避免吸入与β-巯基乙醇有关的刺激性气味。
  • 可在室温条件下处理。
  • 可在15分钟内剥离抗体。

 

这些方法都不能去除显色检测系统所产生的有色沉淀(如BCIP、4CN、DAB和TMB)。但是,仍可以利用靶向不同目标蛋白的另一种抗体来分析印迹。

通常,这些方案仅能用于定性用途,除非已经确定剥离过程不会影响指定抗原的定量结果。许多抗原将经历至少5次剥离循环,具体取决于所用的方法和膜类型。但是,应该考虑到在每个剥离循环中,都将洗去少量的膜固定蛋白。如果需要连续检测几种抗原,建议从预期丰度较低或产生信号较少的抗原开始。

在设计具有一轮或多轮抗体剥离的免疫印迹实验时,可参考以下建议。

  • PVDF膜比硝酸纤维素膜更稳健,因此推荐用于任何涉及抗体剥离的方案。
  • 从SDS-PAGE凝胶转印完成后立即干燥PVDF膜,可改善蛋白质与膜的结合,特别推荐用于涉及多次剥离的实验。在第一轮免疫检测之前,必须使用乙醇将干燥的PVDF膜润湿。
  • 最先检测低丰度抗原。
  • 先使用低亲和抗体,再使用高亲和抗体。
  • 重要:尽管建议在转印后立即干燥PVDF印迹,但不可在两轮免疫检测之间干燥印迹,否则,任何残留的抗体分子将与膜永久结合。

方案1:通过加热和去污剂剥离

所需设备和溶液

  • 标准印迹或印迹条,在硝酸纤维素或PVDF膜上。
  • 封闭液。
  • 剥离溶液:100 mM 2-巯基乙醇(M3148),2% (w/v) SDS (L3771),62.5 mM Tris-HCl (T6666)、pH 6.7
  • 磷酸盐缓冲液(PBS):10 mM 磷酸钠、pH 7.2,0.9%(w/v)NaCl。
  • 浅托盘,能容纳膜
  • 阳性和阴性剥离对照。

步骤

  1. 在通风橱内,将印迹放入剥离溶液中,50°C摇动孵育30分钟。
  2. 将印迹放入缓冲液中,摇动10分钟。使用新鲜的缓冲液重复一次。
  3. 确保抗体已失活或从膜上剥离。
  4. 将印迹放入缓冲液中,摇动10分钟。
  5. 继续进行封闭步骤,进行下一轮的免疫检测。

方案3:利用ReBlot™ Plus Western Blot Recycling Kit(抗体剥离试剂盒)剥离抗体

Re-Blot Plus Mild抗体剥离液对硝酸纤维素和PVDF膜均具有良好的剥离效果。但在待剥离膜具有较高信号或Re-Blot Plus Mild处理不充分时效果更好。

所需设备和溶液

  • 标准印迹或印迹条,在硝酸纤维素或PVDF膜上。
  • 封闭液。
  • 保鲜膜,用于保存不会立即再次检测的印迹。
  • ReBlot™ Plus Kit(抗体剥离试剂盒)
  • 蒸馏水,用于稀释试剂。
  • 浅托盘,能容纳膜。
  • 阳性和阴性剥离对照。

步骤

注意:若要重复使用印迹或单个印迹条,应在第一次使用后立即剥离。如果不能立即剥离,应将膜包在保鲜膜中并置于PBS中,保存在4°C。切勿将印迹干燥保存。

  1. 在塑料托盘中加入适量的1X Antibody Stripping Solution(试剂盒中提供)
  2. 用镊子将印迹或印迹条浸入剥离液中。在室温下,轻轻混合孵育15分钟。
  3. 在一个干净的塑料托盘中装入相同量的封闭液。可使用传统的封闭液,如20 mM Tris HCL、pH 8.0,150 mM NaCl,0.1% 吐温20,5%奶粉,或者类似溶液。
  4. 使用封闭液清洗印迹2次,每次5分钟。
  5. 现在,可使用抗体再次检测印迹。

 

材料