贴壁细胞系的传代培养

Cook Book  2010年9月第12卷,细胞培养实验室基础技术手册 - 第2版
 

实验方案3 — 贴壁细胞系的传代培养

12.4 实验方案3 — 贴壁细胞系的传代培养


 目标

贴壁细胞系将在体外生长,直到它们覆盖可用的表面积或培养基营养物耗尽为止。此时,细胞系应进行传代培养,以防止培养物死亡。为了传代培养细胞,需要将它们悬浮。粘附程度随细胞系的不同而不同,但在大多数情况下,需要用蛋白酶(例如胰蛋白酶)使细胞从烧瓶上脱落。然而,这种方法可能不适用于某些细胞系,因为蛋白酶对它们有害,或者所使用的酶会去除感兴趣的胞膜标记物/受体。在这些情况下,应借助细胞刮刀以机械方法使细胞悬浮于少量培养基中。


 材料

  • 培养基 — 预热至到37°C(有关正确的培养基,请参阅ECACC细胞系数据表)
  • 70%(v/v)异丙醇,溶于无菌水中
  • PBS,不含Ca2+/Mg2+
  • 0.25%胰蛋白酶 / EDTA,溶于HBSS中,不含Ca2+/Mg2+
  • 黄豆胰蛋白酶抑制剂
  • 台盼蓝(活体染色)

 设备

  • 个人防护装备(无菌手套、实验室外套、护目镜)
  • 设置到适当温度的水浴
  • 适当密封水平的微生物安全柜
  • 培养箱
  • 预先标记的烧瓶
  • 倒置相差显微镜
  • 离心机
  • 血球计数器
  • 标记笔
  • 移液管
  • 安瓿瓶架
  • 纸巾

 操作步骤

  1. 使用倒置显微镜观察培养物,以评估汇合度,并确认不存在细菌和真菌污染物。
  2. 除去用过的培养基。
  3. 用不含Ca2+ / Mg2+的PBS洗涤细胞单层,用量相当于培养基体积的一半。如果细胞粘附牢固,则重复该洗涤步骤。
  4. 按照每25cm2表面积1 ml的用量,移取胰蛋白酶 / EDTA到洗过的细胞单层上。旋转烧瓶以使胰蛋白酶覆盖单层。倒出多余的胰蛋白酶。
  5. 将烧瓶放回到培养箱,静置2-10分钟。
  6. 使用倒置显微镜查看细胞,确保所有细胞都脱离并漂浮。可以轻拍烧瓶的侧面以使任何剩余的贴壁细胞脱落。
  7. 将细胞重悬于少量新鲜的含血清培养基中,以灭活胰蛋白酶。去除100-200 μl,然后进行细胞计数(参见实验方案6 — 细胞定量)。如果细胞是用无血清培养基培养的,则使用胰蛋白酶抑制剂,例如黄豆胰蛋白酶抑制剂灭活胰蛋白酶。
  8. 将所需数量的细胞转移到含有预热培养基的带标签的新烧瓶中(有关所需的接种密度,请参阅ECACC细胞系数据表)。
  9.  适当孵育细胞系。
  10. 视细胞系生长特征的需要,重复该过程。

 重点

  1. 有些培养物虽然是作为贴壁细胞系生长的,但只是稍微附着在瓶壁,因此必须确保保留培养基,且在挪动烧瓶时必须多加小心,以防细胞过早脱落。
  2. 尽管大多数细胞能够在仅有胰蛋白酶存在的情况下分离,但加入EDTA可以增强酶的活性。
  3. 当有血清存在时,胰蛋白酶失活。因此,必须用不含Ca2+ / Mg2+的PBS洗涤单层细胞,以从培养基中清除所有痕量的血清。
  4. 细胞应仅暴露于胰蛋白酶 / EDTA足以脱落的时间。过长时间暴露可能会损害细胞表面受体。
  5. 在将细胞接种到新瓶之前,应使用血清中和胰蛋白酶,否则细胞不会附着。
  6. 还可以通过添加黄豆胰蛋白酶抑制剂来中和胰蛋白酶,即向胰蛋白酶消化的细胞中加入等体积的浓度为1 mg/ml的抑制剂。然后将细胞离心,重悬于新鲜培养基中,然后如上所述计数。这对于无血清细胞培养物尤其必要。
  7. 如果没有CO2培养箱,则向培养烧充经过0.2 μm过滤器过滤的含有5% CO2和95%空气的气体1-2分钟。
  8. 如果收获的细胞密度太低而不能以适当的细胞密度重新接种于新的烧瓶中,则可能需要离心细胞,例如5分钟、150 x g,然后重悬于较小体积的培养基中。

 你知道吗?

无血清培养基不会灭活胰蛋白酶。因此必须使用胰蛋白酶抑制剂,例如黄豆胰蛋白酶抑制剂。


 材料