半贴壁细胞系的传代培养

Cook Book 2010年9月第12卷

实验室细胞培养基础技术手册-第2版

 

12.5方案4 - 半贴壁细胞系的传代培养

 

 

目的

一些培养物以混合群体(例如B95-8 - 狨猴)生长,其中一部分细胞不附着于组织培养物并保持悬浮。因此,为了保持这种异质性,必须对附着细胞和悬浮细胞进行传代培养。

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材料

  • 预热至37°C的培养基(有关恰当的培养基,请参阅ECACC细胞系数据表)
  • 70% (v/v)异丙醇的无菌水溶液
  • 不含Ca2+/Mg2+的PBS
  • 0.25%胰蛋白酶/EDTA的HBSS溶液,不含Ca2+/Mg2+
  • 大豆胰蛋白酶抑制剂
  • 台盼蓝(活体染料)

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设备

  • 个人防护装备(无菌手套,实验室外套,安全帽)
  • 设置至适当温度的恒温水槽
  • 具有适当密封性的微生物安全柜
  • 离心机
  • 倒置相差显微镜
  • 培养箱
  • 细胞计数板
  • 预先标记的培养瓶
  • 记号笔
  • 移液器

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步骤

  1. 使用倒置相差显微镜观察培养物,评估融合程度并确认未受细菌和真菌污染。首先轻轻敲击培养瓶瓶,这可以使细胞脱离培养瓶壁,而无需胰蛋白酶消化步骤,也不会因后续洗涤而损失细胞。
  2. 将含有非贴壁细胞的培养基转移到无菌离心管中保留。
  3. 用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤剩余的贴壁细胞,每25 cm2的表面积使用1-2 ml。保留洗涤物。
  4. 用移液器将胰蛋白酶/EDTA按照1 ml/25 cm2表面积加到洗过的单层细胞上。转动培养瓶,使胰蛋白酶覆盖细胞层。倒出多余的胰蛋白酶。
  5. 将培养瓶放回培养箱中,静置2-10分钟。
  6. 使用倒置显微镜检查细胞,确保所有细胞分离并漂浮。轻轻拍打培养瓶侧面,使剩余的贴壁细胞脱落(参见方案6 - 细胞定量)。
  7. 将细胞转移到保留有的用过的培养基和细胞的离心管中。
  8. 将所有细胞悬浮液150 x g离心5分钟。
  9. 弃上清,将细胞沉淀重悬于少量 (10-20 ml) 新鲜培养基中。对细胞进行计数。
  10. 用移液器将所需数量的细胞转移到标记的新培养瓶中,使用新鲜培养基稀释至所需体积(有关接种密度,请参阅ECACC细胞系数据表)。
  11. 必要时每2-3天重复此过程。

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要点

  1. 虽然大多数细胞在只有胰蛋白酶存在的情况下就会分离,但是添加EDTA可增强酶的活性。
  2. 胰蛋白酶在血清存在的条件下会失活。因此,必须用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗涤单层细胞来将所有痕量血清从培养基中除去。反复升温至37℃也会使胰蛋白酶失活。
  3. 细胞接触蛋白酶/EDTA的时间应仅够分离细胞。长时间接触可能会损害细胞表面受体。通常,与贴壁细胞系相比,半贴壁细胞系所需的胰蛋白酶接触时间更短。
  4. 在将细胞接种到新培养瓶中之前,应用血清中和胰蛋白酶,否则细胞不会贴壁。
  5. 还可以添加大豆胰蛋白酶抑制剂来中和胰蛋白酶,即向胰蛋白酶消化的细胞中加入等体积的浓度为1 mg/ml的抑制剂。如上所述,然后将细胞离心,重悬于新鲜培养基中并计数。
  6. 如果没有CO2培养箱,可将培养瓶在0.2 μm过滤器过滤的含有5% CO2的95%空气中放置1-2分钟。

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