通用SYBR绿色定量PCR协议


 技术槪述:基于SYBR的定量PCR

 

随着具有荧光检测功能的热循环仪的发展,PCR具有了新的创新应用。在常规PCR中,关键结果是在该过程后产生的最终扩增子数量。实时或定量PCR和RT-PCR使用DNA扩增的线性性来确定样品中已知序列的绝对或相对量。通过在反应中使用荧光报告子,可以测量DNA产生。
在定量PCR中,每个PCR循环上的DNA扩增都得到监测。当DNA处于对数线性扩增阶段时,荧光量增加到背景之上。荧光变得可测量的那一点称为定量循环(Cq)或交叉点。通过使用已知量的标准DNA的多次稀释,可以产生对比Cq的对数浓度的标准曲线。然后可以从其Cq值计算未知样品中DNA或cDNA的量。
 qPCR技术槪述

 

A)反应的不同阶段:
基线:模板初始浓度低,因此荧光强度太低而不能被检测到,只有背景信号是明显的。
指数:在靶样产量达到检测阈值(显示为红色阈值线)后,在整个指数阶段可以跟踪反应过程。
线性:随着模板浓度的增加,可用的DNA聚合酶浓度降低,反应速率降低。
高原:没有足够的游离酶继续扩增,因此在这个点之后,反应处于最大产量期,也就是平台期。


B)个体反应的特征在于荧光首先升高到阈值以上的循环,其被称为定量循环(Cq)。如果起始材料丰富,则会在较早的循环中观察到扩增,这种情况中Cq较低。如果起始材料稀缺,则在后续循环中观察到扩增,Cq较高。荧光、Cq和扩增产物的量之间的这种相关性,使得能够在宽动态范围内定量模板。

实时PCR也适用于相关研究。可以使用对每个待扩增区域独特的引物进行反应,并用不同的荧光染料标记。几种市售的定量热循环仪包括多个检测通道。在该多重系统中,可以将靶DNA / cDNA的量与管家序列(例如GAPDH或β-肌动蛋白)的量进行比较。

 

SYBR绿色定量PCR应用
质量筛选 XX
微阵列验证 XX
多个靶基因 / 少量样品 X
SNP检测 NR
等位基因鉴别 NR
病原体检测 X
多路复用(Multiplexing) NR
病毒载量定量 NR
基因表达分析 X
基因变性测定 NR
终点基因分型 NR
体外定量 NR
NR= 不推荐
X= 推荐
XX= 首选方法



有关其他信息,请参阅qPCR技术指南基于SYBR Green I的qPCR技术动画


 测定的考虑因素

DNA的制备
确保PCR成功的最重要一步是高质量的DNA制备。DNA模板的完整性和纯度至关重要。定量PCR涉及多轮酶促反应,因此对蛋白质、苯酚/氯仿、盐、EDTA和其他化学溶剂等杂质更加敏感。污染物也会干扰荧光检测。在260nm和280nm处的吸光度值的比率给出了DNA纯度的估计值。纯DNA的A260 / A280比率为1.8-2.0,较低的比率表明存在诸如蛋白质的污染物。

模板
启动qPCR需要非常少的靶核酸变性(相当于约100 pg的gDNA或cDNA)。为了尽量减少反应抑制剂的污染,应将起始模板量保持在实现精确定量所需的最小值。当起始材料是RNA时,引物设计和DNase I处理将减少可能由gDNA污染产生的信号。

引物设计
无论是使用dsDNA结合染料还是基于探针的检测化学,设计高质量引物都是qPCR中最关键的实验前步骤之一。应使用引物设计软件来设计PCR特异性引物,以消除引物二聚体和二级结构引入的复杂问题。较低的引物浓度降低了引物二聚体形成和非特异性产物形成的积累,这对于在定量PCR中使用SYBR Green I染料是至关重要的。

dNTP
标准PCR / qPCR预混液含有dATP、dCTP、dGTP和dTTP。然而,有些可用的混合物用dUTP代替了dTTP。使用dUTP进行的先前反应的产物将含有尿嘧啶而不是胸腺嘧啶。所以它们易受尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)的切割。因此,事先用UNG孵育后续反应物可防止反应之间的携带污染物。为了有效,实验室中的所有反应都必须使用dUTP。 

镁浓度
氯化镁(MgCl2)是逆转录酶、Taq DNA聚合酶和Taq DNA 5'至3'核酸外切酶活性所必需的。含有DLP的反应物的最佳Mg2+浓度通常在3 - 6 mM之间。较低的氯化镁浓度通常导致较少的非特异性产物的形成。某些ReadyMix溶液以2X浓度的7 mM氯化镁(终浓度为3.5 mM)提供。在某些情况下,如果需要,提供一小瓶25 mM氯化镁溶液以进一步优化最终的氯化镁浓度。有时可能需要不含MgCl2的反应混合物,从而可以使用低浓度,例如使用Scorpion探针检测时。

逆转录酶
提供高产量cDNA、同时在高温下保持活性的逆转录酶对RT-qPCR的成功至关重要。高温下的性能有助于去除具有显著二级结构的RNA区域的稳定性,从而易于杂交和随后扩增。当进行一步法RT-qPCR时,高温性能允许使用具有高解链温度(Tm)的基因特异性引物,这增加了反应特异性。当进行两步方案时,重要的是确保酶能够使来自RNA的cDNA具有线性、成比例的产率。尽量减少的移液步骤可以减少差异性。一些ReadyMix包含进行RT所需的引物和其他试剂,例如ReadyScript® cDNA合成混合物(RDRT)。

Taq DNA聚合酶
与为RT选择最合适的逆转录酶一样,选择合适的酶至关重要。天然Taq DNA聚合酶的一个基本问题是酶在低温下具有残余活性。由于这种残留的聚合酶活性,非特异性引物结合导致非特异性产物形成。抗体阻断或化学阻断的Taq DNA聚合酶(“热启动”)有助于通过阻止酶活性来纠正这种情况,直到高温变性步骤开始。请参阅PCR混合液选择指南以确定适合您应用的最佳热启动聚合酶。

按仪器类型选择内部参比染料
一些实时PCR热循环仪需要诸如ROX的上样染料来控制光学系统的可变性,并标准化信号强度的差异。同样地,一些热循环仪在使用SYBR Green I染料(具有非常低的背景)测定时,需要荧光素来产生虚拟背景。这些可以在ReadyMix中提供,或作为单独的组分提供,因此可以使用适当的浓度。在某些情况下,会包括一小瓶内部参比染料用于反应标准化。该染料的最大激发波长为586nm,最大发射波长为605nm。ROX参比染料的标准仪器设置对于内部参比染料的测量是令人满意的。这种内部参比染料是ABI序列检测系统所必需的。

仪器
需要选择与仪器兼容的试剂。平台使用不同的标准化染料,因此需要选择具有相容标准化染料的试剂(请参见附录1)。

许多qPCR仪器设计用于支持特定范围的应用,例如,ABI 7900具有高通量能力,384孔板自动上样,而Illumina Eco则支持单个48孔板。选择最合适的仪器满足研究需要。理想的做法是选择具有用户友好软件的仪器,软件执行最想要的功能,并且具有灵活的数据输出方式,以便下游统计分析软件包更易于操作数据。这减少了培训人员所需的时间,分析结果好。所需的其他功能包括一个绝对统一的PCR模块(96个复制孔的绝对最大偏差为1Cq = 2倍),以及一个光学系统,可以在很宽的波长范围内灵敏、均匀地激发和检测发射光。这允许广泛地选择荧光团,并实现多路复用。另外还要考虑的其他特点是与特定耗材相关的运作成本,例如,如果在反应中不使用标准微量滴定板,那么就需要考虑非标准型的上样板或管的方便性。

对照
阳性对照始终有助于确保所有的试剂盒组分正常工作。无需用模板 / 阴性对照来确定是否存在污染。无模板对照中的信号表明存在DNA污染或引物二聚体形成。

缓冲液
缓冲液或反应混合物通常含有dNTP、Taq DNA聚合酶、MgCl2和稳定剂。取决于检测化学、仪器和反应要求,可能还需要SYBR Green I、ROX™、荧光素和惰性加载染料。PCR缓冲液组分和稳定剂通常是制造商专有的。如果单独购买,可以实现最大的灵活性,因为每种成分都可以在反应中单独优化。然而相反,虽然购买将所有成分混在一起的预混液用起来不太灵活,但它提高了批次的一致性和便利性,同时减少了移液步骤,从而减少错误和污染的可能性。

数据分析
建议使用推荐的实时仪器进行定量SYBR Green PCR。以下内容可能对仪器新用户有帮助。通常会绘制循环数与荧光的关系图。循环阈值(CT)或交叉点用来确定每个样品中的模板量。循环阈值或交叉点是能够检测到由于PCR产物的形成而导致的荧光增加的第一个循环。交叉点之前的循环是基线循环。基线循环是指由于PCR产物的存在而引起的荧光增加尚未达到可检测水平时的循环。用于确定何时发生第一次可检测的荧光增加的阈值也可以手动调节。必须在对数扩增图上绘出阈值。在对数扩增图中,阈值应设置在对数线性范围内,而不是高原阶段。

解链曲线
在运行结束时进行解链曲线分析将有助于仅分析感兴趣的PCR产物。按照实时仪器制造商的说明进行解链曲线分析。通过在另外的循环步骤中收集数据,可以修改使用相同引物的连续反应,以去除引物二聚体形成对产物信号的影响,但所述循环的温度必须介于已经确定的二聚体和产物解链温度(TM)之间。


 定量方法

标准曲线
标准曲线对于绝对和相对定量都是必需的。当生成标准曲线时,应使用不同浓度的DNA(通常为5个)来生成标准曲线,该曲线将包含未知样品的浓度。每种浓度应一式两份。

绝对和相对量化
该SYBR Green PCR试剂盒可用于使用绝对或相对定量技术对靶DNA进行量化。绝对定量技术用于确定初始样品中靶DNA的量,而相对定量则确定靶DNA量与参照扩增子之间的比率。理想的参照扩增子将具有不变的组成型表达。在实践中,选择管家基因用于此功能,但还有其他参考选择更好地符合上述要求。1

绝对定量使用外部标准来确定目标靶核酸的绝对量。为了消除退火引起的定量差异,外部标准的引物结合位点必须与靶序列中的引物结合位点相同。理想的外部标准包含与靶序列相同或仅与靶序列稍微不同的序列。对于绝对定量,靶样与外部标准之间的扩增效率必须相当。一旦确定出合适的构建体或扩增子,就产生​​外部标准稀释液的标准曲线,并用于确定未知靶样的浓度。

相对定量允许计算样品中靶模板和参照模板之间的数量比。由于该方法测量靶样相对于假定不变的对照样的数量,因此相对qPCR最常用于测量遗传多态性差异,例如,组织之间或健康与疾病样品之间的差异。该技术的优点是使用内部标准可以最大程度地减小样品制备和处理中的差异。使用SYBR系统时,必须在单独的反应中运行靶样和内部参照量化。

相对量化的准确性取决于标准中参照模板的适当选择。标准的差异性将影响结果,因此最重要的是标准是合适的。1一些研究人员选择不运行标准曲线,并将靶数量报道为参照量的分数,这种技术称为比较定量。另外,还可以假设靶样和参照样的扩增效率可以忽略不计,而只是基于为参照序列确定的标准曲线来量化靶样。最后,在最准确的相对量化技术中,测量参照样和靶样的扩增效率,并确定校正因子。该过程称为标准化,1 需要含有已知浓度的靶样及参照样,并且需要生成两条标准曲线。

PCR反应效率的测定
通过为每个靶样制备连续稀释液,来确定参照样与靶样之间的PCR效率。从靶样中减去参照样的CT值,并将这个CT值的差相对于模板量的对数作图。如果得到的直线斜率小于±0.1,则判断扩增效率相似。


 设备

  • 定量PCR仪器
  • 微量离心管
  • PCR设置的层流罩(选购件)

用品

  • qPCR SYBR Green混合液 — 请参阅qPCR选择指南(第1部分第2部分
  • DNA / cDNA模板 — cDNA反应,以1:10稀释,用于检测中等至高度表达的靶样,或以1:2至1:5稀释,用于罕见转录或或10 ng至100 ng gDNA
  • 正向和逆向引物,稀释至工作浓度(10 μM工作原液足以进行大多数检测)
  • 无菌过滤器移液管吸头
  • 无菌1.5 mL螺纹盖微量离心管(例如CLS430909
  • PCR管,选择匹配所需形式的试管:
  • PCR级纯水(W1754


 SYBR Green PCR 混合液选择指南 — 第1部分

 

完全热启动ReadyMix(Taq、缓冲液、dNTP、参比染料、MgCl2
兼容仪器:
Bio-Rad CFX384™
Bio-Rad CFX96™
Bio-Rad MiniOpticon™
BioRad MyiQ™
Bio-Rad/MJ Chromo4™
Bio-Rad/MJ Opticon 2
Bio-Rad/MJ Opticon® Cepheid SmartCycler®
Eppendorf Mastercycler® ep realplex
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s
Illumina Eco qPCR Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q
Roche LightCycler™ 480
兼容仪器:
Applied Biosystems 7500
Applied Biosystems 7500
Fast Applied Biosystems ViiA 7
Stratagene Mx3000P®
Stratagene Mx3005P™
Stratagene Mx4000™
兼容仪器:
Applied Biosystems 5700
Applied Biosystems 7000
Applied Biosystems 7300
Applied Biosystems 7700
Applied Biosystems 7900
Applied Biosystems 7900 HT Fast
Applied Biosystems 7900HT
Applied Biosystems StepOnePlus™
Applied Biosystems StepOne™
兼容仪器:
BioRad iCycler iQ™
BioRad iQ™5
BioRad MyiQ™
兼容仪器:
Applied Biosystems 5700
Applied Biosystems 7000
Applied Biosystems 7300
Applied Biosystems 7700
Applied Biosystems 7900
Applied Biosystems 7900 HT Fast
Applied Biosystems 7900HT
Applied Biosystems StepOnePlus™
Applied Biosystems StepOne™
兼容仪器:
Bio-Rad CFX384™
Bio-Rad CFX96™
Bio-Rad MiniOpticon™
BioRad MyiQ™
Bio-Rad/MJ Chromo4™
Bio-Rad/MJ Opticon 2
Bio-Rad/MJ Opticon® Cepheid SmartCycler®
Eppendorf Mastercycler® ep realplex
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s
Illumina Eco qPCR Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q
Roche LightCycler™ 480
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™
(KCQS00)
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 低Rox含量
(KCQS01)
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 含有ROX
(KCQS02)
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 用于iQ
(KCQS03)
SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ 用于大通量qPCR
(S9194)
SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ ,用于定量PCR,毛细管配方n
(S1816)


 SYBR Green PCR 混合液选择指南 — 第2部分

 

热启动ReadyMix及组分
单独供应的参比染料 单独提供的MgCl2
单独供应的参比染料
兼容仪器:
请参阅附录1查找仪器的最佳参比染料浓度
SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™
(S4438)
LuminoCt®SYBR®Green qPCR ReadyMix™
(L6544)
SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™
(S5193)


 实验方案

准备

  1. 将所有反应组分置于冰上。
  2. 混合,然后短暂离心以收集管底部的内容物。

标准SYBR Green I染料反应

说明:我们观察到,当使用比常规PCR更高的引物浓度时,在KiCqStart ReadyMix中运行的测定是最佳的。在下面的实验方案中,我们使用450nM终浓度,我们观察到这是几种独立测定的最佳浓度。

  1. 准备足够的预混液,以一式两份运行所有样品。
    1. 请务必包含一式两份无模板阴性对照样(NTC)。
    2. 根据所选的qPCR试剂选择下面的相应表格。
    3. 计算要混合的试剂量。增加10%的体积,以防移液错误时备用。
    4. 混合均匀,避免气泡。
  2.  

    KiCqStart试剂的预混液:

     

    反应 靶样终浓度 每单份20 μL反应物的体积 (μL)
    2X qPCR混合液 1X 10 μL
    正向引物(10 μM原液) 0.45 µM 0.9 μL
    逆向引物(10 μM原液) 0.45 µM 0.9 μL
    PCR级纯水 - 3.2 μL

     

    其他完全qPCR ReadyMix的预混液 :

     

    反应 靶样终浓度 每单份20 μL反应物的体积 (μL)
    2X qPCR混合液 1X 10 μL
    正向引物(10 μM原液) 0.2 µM 0.4 μL
    逆向引物(10 μM原液) 0.2 µM 0.4 μL
    PCR级纯水 - 4.2 μL

     

    qPCR试剂与单独组分的预混液:

     

    反应 靶样终浓度 每单份20 μL反应物的体积 (μL)
    2X qPCR混合液 1X 10 μL
    正向引物(10 μM原液) 0.2 µM 0.4 μL
    逆向引物(10 μM原液) 0.2 µM 0.4 μL
    25mM MgCl2 (如果单独供应) 3.5mM 3.5 μL1
    参比染料(如果单独提供)   0 to 0.25 μL2
    PCR级纯水   4.2 μL

     

    1 最佳MgCl2 浓度可以为1 mM至6 mM。
    2 请参阅附录1查找仪器的最佳参比染料浓度。

  3. 设置反应:
    1. 对于NTC反应,向反应管中添加4 μL水。
    2. 对于实验反应,向反应管添加4 μL cDNA溶液。
    3. 短暂离心所有试管。目测确认所有试管或孔在底部都含有正确体积的样品。
    4. 小心地将16 μL模板预混液等分到每个qPCR管或板孔中。
    5. 充分混合反应物并视需要离心。
    6. 给试管盖上盖子,或密封好板子,并贴上标签(根据仪器要求)。(确保标签不会遮挡仪器的激发/检测光路。)
     
  4. 根据仪器制造商的建议运行样品。下面将给出标准和快速循环的例子。
  5. 标准循环参数:

     

      温度 时间
    初始变性 94 °C 2 min
    40 个循环:
    变性 94 °C 15 sec

    退火、延伸、
    以及读取荧光

    60 °C或比最低
    引物温度TM 低5 °C

    1 min
    (任选)保持 4 °C,只当产品在凝胶上运行时

     

    快速循环参数:

     

      温度 (ºC) 时间 (s)
    初始变性 95 30
    40个循环:
    第1步 95 5
    第2步 58 15
    第3步 72 10

    说明:使用标准解离曲线实验方案(数据收集)。

     

  6. 有关如何分析数据的指南,请参阅仪器手册。


 附录1

推荐用于仪器的参比染料浓度。对于参比染料单独供应的qPCR试剂

 

仪器 参比染料的终浓度 参比染料的µL(每20 µL反应物)
Applied Biosystems 5700 1X 0.2µL
Applied Biosystems 7000 1X 0.2µL
Applied Biosystems 7300 1X 0.2µL
Applied Biosystems 7500 0.1X 0.02µL
Applied Biosystems 7500 Fast 0.1X 0.02µL
Applied Biosystems 7700 1X 0.2µL
Applied Biosystems 7900 1X 0.2µL
Applied Biosystems 7900 HT Fast 1X 0.2µL
Applied Biosystems 7900HT 1X 0.2µL
Applied Biosystems StepOnePlus™ 1X 0.2µL
Applied Biosystems StepOne™ 1X 0.2µL
Applied Biosystems ViiA 7 0.1X 0.2µL
Bibby Scientific Techne® Prime Pro 48 未使用 -
Bibby Scientific PCRmax® Eco 48 未使用 -
Bio-Rad CFX384™ 未使用 -
Bio-Rad CFX96™ 未使用 -
Bio-Rad MiniOpticon™ 未使用 -
Bio-Rad/MJ Chromo4™ 未使用 -
Bio-Rad/MJ Opticon 2 未使用 -
Bio-Rad/MJ Opticon® 未使用 -
Cepheid SmartCycler® 未使用 -
Eppendorf Mastercycler® ep realplex 未使用 -
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s 未使用 -
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000 未使用 -
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000 未使用 -
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q 未使用 -
Roche LightCycler™ 480 未使用 -
Stratagene Mx3000P® 0.1X 0.02µL
Stratagene Mx3005P™ 0.1X 0.02µL
Stratagene Mx4000™ 0.1X 0.02µL


 故障排除指南

 

问题 可能原因 解决方案
未观察到PCR产物。 PCR组分缺失或降解。 务必运行阳性对照以确保组分功能正常。还建议在组合各个反应时使用核查表。
SYBR降解。 运行琼脂糖凝胶,以分析反应产物。如果有适当尺寸的单个条带明显可见,则检测有误。SBYR Green I对光线敏感,必须加以保护。
退火温度太高。 以2-4°C的增量降低退火温度。
模板质量差。 通过琼脂糖凝胶电泳评估模板完整性。可能需要使用能最小化剪切和切口的方法来重新纯化模板。由于提取或纯化失败,可能没有模板。
引物的设计不是最佳的。 通过在已知模板上运行连续稀释来检查引物组。根据需要重新订购和设计。
初始变性温度持续时间太长。 删除激活步骤。JumpStart Taq可能会在较长(> 3分钟)的初始变性时间内降解。
靶模板很复杂。 在大多数情况下,靶样的固有复杂性是由于异常高的GC含量和/或二级结构造成的。据报道,在0.8-1.3 M的浓度下,甜菜碱有助于扩增高GC含量的模板。2
参比染料不匹配。 对于Rn(标准化荧光)图,关闭参比染料。或者,查看qPCR扩增曲线的原始荧光。删除标准化通常会将图恢复到预期的形状,从而能够计算更合理的Ct值。或者,在反应物中滴定参比染料。查看最后故障排除部分的建议。
执行的循环太少。 增加循环数。
模板不够多。 增加循环次数后没有成功,则用10倍浓度的模板重新反应。
PCR产物太长。 当PCR产物在100-150 bp之间且不超过800 bp时结果最好。
Mg2+ 浓度不是最理想的。 最佳氯化镁浓度随测定的不同而不同,范围从1.5至5 mM不等。使用25 mM MgCl2 (M8787)在该范围内进行氯化镁滴定。
未激活检测,或者在错误的步骤中激活了检测。 确认为正确的检测启动了采集模式。SYBR Green检测的采集模式为“单一”,并且是在延伸步骤或者任选检测步骤中收集。
引物降解。 检查聚丙烯酰胺凝胶上的引物降解。
选择了错误的染料层。 确保在序列检测软件的设置视图中激活了正在使用的报告子。
Y轴上的值不正确 更改y轴上的值。双击ΔRn 即可更改y轴的值。
PCR效率太低(<80%) 退火温度太低。 以2-3°C的增量提高退火温度。
模板包含抑制剂。 运行标准曲线(log [DNA] 与 Cq 的关系曲线)。如果曲线在高DNA / cDNA浓度时是非线性的,则修改DNA / cDNA纯化,或将模板浓度限制在线性范围内。
引物的设计不是最佳的。 运行解链曲线或琼脂糖凝胶,以检查是否存在多个扩增子。
模板质量差。 通过琼脂糖凝胶电泳评估模板完整性。可能需要使用能最小化剪切和切口的方法来重新纯化模板。
初始变性温度持续时间太长。 删除激活步骤。抗体热启动Taq可能会在较长(> 3分钟)的初始变性时间内降解。
多个基因位点与引物组杂交。 运行解链曲线或琼脂糖凝胶,以检查是否存在多个扩增子。或者,对于已测序的靶基因组,用NCBI程序e-PCR寻找多个扩增子。
移液错误导致波动。 制备大量的完全混合物,并将其等分为单独的反应物。如果差异仍然存在,请参阅下文。
用于仪器的参比染料或浓度不正确。 请参阅附录1查找推荐用于仪器的参比染料浓度。
参比染料不匹配。 对于Rn(标准化荧光)图,关闭参比染料。或者,查看qPCR扩增曲线的原始荧光。删除标准化通常会将图恢复到预期的形状,从而能够计算更合理的Ct值。如果需要标准化,则必须通过滴定确定参比染料的最佳量。
信号与模板稀释度无关(有多种产物或产物被模糊)。 退火温度太低。 以2-3°C的增量提高退火温度。
引物的设计不是最佳的。 确认序列信息的准确性。如果引物长度小于27个核苷酸,则尝试加长引物至27-33个核苷酸。如果引物的GC含量低于45%,尝试重新设计GC含量为45-60%的引物。
模板浓度太高。 降低PCR反应中的模板浓度。
引物浓度太高。 连续两倍稀释(例如0.1 μM,0.05 μM,0.025μM和0.0125 μM)降低引物浓度,并将这些试验反应物进行PCR。
PCR效率太高。 多个基因位点与引物组杂交。 运行解链曲线或琼脂糖凝胶,以检查是否存在多个扩增子。或者,对于已测序的靶基因组,用NCBI程序e-PCR寻找多个扩增子。
技术重复返回差异很大的Ct值,或者数据给出无法解释的扩增曲线。 移液错误导致波动。 制备大量的完全混合物,并将其等分为单独的反应物。如果差异仍然存在,请参阅下文。
用于仪器的参比染料或浓度不正确。 请参阅附录1查找推荐用于仪器的参比染料浓度。
样本和/或重复内部差异太大。 反应物混合不均匀。 轻轻涡旋和离心反应物。
板孔未盖紧或盖严。 盖紧或盖严所有板孔,甚至包括空板孔。未盖紧的板孔会影响相邻板孔的密封。
初始变性时间太长。 缩短初始变性进间至不超过两分钟。
多种PCR产物。 引物的设计不是最佳的。 确认序列信息的准确性,以及引物序列对非靶序列的特异性。增加引物的长度,使它们更具靶向特异性。
引物降解。 检查聚丙烯酰胺凝胶上的引物降解。
Mg2+ 浓度不是最理想的。 最佳氯化镁浓度随测定的不同而不同,范围从1.5至5 mM不等。使用25 mM MgCl2 (M8787)在该范围内进行氯化镁滴定。
退火温度太低。 以2-3°C的增量提高退火温度。
污染DNA 检查所有试剂是否存在污染,并在层流罩中设置反应,以防来自其他反应的污染。
引物二聚体被扩增。 在循环程序中包括任选检测步骤,以避免检出引物二聚体。
模板浓度太高。 降低PCR反应中的模板浓度。
引物浓度太高。 连续两倍稀释(例如0.1 μM,0.05 μM,0.025μM和0.0125 μM)降低引物浓度,并将这些试验反应物进行PCR。
交叉点值的线性部分不对应于模板量的对数扩增部分。 模板量太高。 请勿超过模板DNA的最大推荐量。
模板量太低。 提高DNA的数量。
污染DNA 检查所有试剂是否有污染,并在层流罩中设置反应,以防交叉污染。
引物二聚体被扩增。 在循环程序中包括任选检测步骤,以避免检出引物二聚体。
未检测到荧光,或者荧光是可变的。 SYBR Green ReadyMix未充分混合。 使用前彻底混合ReadyMix,以确保SYBR Green以适当浓度添加到所有毛细管中。
定量PCR仪器受到污染。 根据制造商的说明对仪器进行消毒。
扩增曲线达到最大值,然后在高模板量时降低。 减少用于基线计算的循环数。基线校正过度补偿并使信号变负。
暴露时间不当。 如果使用盖子(25)或光学粘胶盖(10),适当改变暴露时间。

 


 材料

     


 参考文献

  1. Bustin, S. A., Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems, J. Mol. Endocrinol. 29, 23-9 (2002).
  2. Rees, W. et al., Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting, Biochemistry, 32, 137-144 (1993).
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  7. Kellogg, D. E., et al., TaqStart Antibody: "hot start" PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase. BioTechniques 16, 1134-1137 (1994).

法律信息

JumpStart和ReadyMix是Sigma-Aldrich Biotechnology LP和Sigma-Aldrich Co.的商标。Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA.
SYBR是Life Technologies的注册商标。
KiCqStart是Quanta BioSciences Inc.的注册商标。
LuminoCt是Sigma-Aldrich Biotechnology LP和Sigma-Aldrich Co.的注册商标。
Bio-Rad是Bio-Rad Laboratories, Inc.的注册商标。
CFX384是Bio-Rad Laboratories, Inc.的商标。
CFX96是Bio-Rad Laboratories, Inc.的商标。
Chromo4是Bio-Rad Laboratories, Inc.的商标。
LightCycler是Roche Molecular Systems, Inc.的注册商标。
Mastercycler是Eppendorf AG的注册商标。
MiniOpticon是Bio-Rad Laboratorie, Inc.的商标。
Opticon是Bio-Rad Laboratories, Inc.的商标。
Rotor-Gene是Qiagen Group的注册商标。
SmartCycler是Cepheid, Inc.的注册商标。
Mx3000P是Agilent Technologies, Inc.的注册商标。
Mx3005P是Agilent Technologies, Inc.的注册商标。
Mx4000是Agilent Technologies, Inc.的商标。
ROX是Applera Corporation或其在美国和/或某些其他国家/地区的子公司的商标。
StepOne是Applera Corporation或其在美国和/或某些其他国家/地区的子公司的商标。
StepOnePlus是Applera Corporation或其在美国和/或某些其他国家/地区的子公司的商标。
MyiQ是Bio-Rad Laboratories, Inc.的商标。
iCycler iQ是Bio-Rad Laboratories, Inc.的注册商标。
iQ是Bio-Rad Laboratories, Inc.的商标。