细胞培养方案 9: 通过培养分离检测细胞支原体污染

ECACC Laboratory Handbook 第四版

 目的

培养法检测支原体是检测的参照方法,具有 1 个菌落形成单位 (cfu) 的理论检测水平。然而,有一些支原体菌株是不可培养的(某些猪鼻支原体菌株)。该方法适用于细胞培养和细胞培养试剂中支原体的检测,4 周内获得结果。在琼脂平板上观察到的支原体菌落具有“煎蛋”形外观。

目的

 

 材料

  • 无菌水中的 70% (v/v) 异丙醇
  • 支原体平板(在 5 cm 培养皿中)
  • 支原体马血清肉汤(1.8 mL 等分)
  •  口腔支原体  (NCTC* 10112)
  •  肺炎支原体  (NCTC*10119)

*可从国家典型培养物保藏中心 (NCTC) 获得

 

 设备

  • 个人防护用品(无菌手套、实验服、护目面罩)
  • 水浴设置为 37°C
  • 微生物安全柜具有合适的生物安全水平
  • 培养箱设置在 37°C
  • 厌氧罐系统

 步骤

  1. 用 0.1 mL 供试品接种 2 个琼脂平板。
  2. 用 100 cfu 的每种对照生物接种琼脂平板。
  3. 留 1 个未接种琼脂平板作为阴性对照。
  4. 使用 0.2 mL 供试品接种 1 肉汤。
  5. 用 100 cfu 的每种对照生物接种肉汤。
  6. 留 1 份未接种肉汤作为阴性对照。
  7. 37℃ 厌氧培养琼脂平板 14 天。
  8. 在 37°C 有氧条件下培养肉汤 14 天。
  9. 在培养的第 3-7 天和第 10-14 天之间,将 0.1 mL 测试肉汤传代培养到琼脂平板上,并如上所述厌氧培养平板。
  10. 使用倒置显微镜在 x400 放大倍数阳离子条件下培养 14 天后观察琼脂平板是否存在支原体菌落。

结果有效的标准

所有阳性对照琼脂平板和肉汤通过琼脂平板上典型的菌落形成和肉汤中的颜色变化显示支原体存在的证据。所有阴性对照琼脂平板和肉汤均未显示支原体。

阳性结果的标准

感染支原体的试验琼脂平板显示典型的菌落形成。

结果无效的标准

试验琼脂平板没有证据显示支原体的存在。

 

 注

  1. 支原体菌落 由于不透明的颗粒状中央生长区穿透琼脂并被表面平坦的半透明周边区包围,因此具有典型的菌落形成,通常称为“煎蛋”。
  2. 肺炎支原体 是一种潜在的病原体,必须在符合 ACDP 第 2 类条件的第 2 类微生物安全柜中操作。
  3. 该试验规程应在远离细胞培养实验室的微生物实验室中进行。
  4. ECACC 建议使用至少两种检测方法(例如间接 DNA 染色和培养分离)对样本进行支原体检测,以获得更可靠的结果。这是由于不同种类支原体的检测灵敏度是不同的。
  5. ECACC 还提供支原体筛选 PCR 检测,可在 24 小时内返回结果。
 

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