用于转化的感受态细胞

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 用于转化的感受态细胞的背景

转化是水平基因转移的过程,通过该过程,一些细菌从环境中吸收外来遗传物质(裸DNA)。Griffith于1928年首次在肺炎链球菌中报道了它。1 1944年Avery等人证实了DNA的转化原理。2转化基因转移的过程不需要活体供体细胞,只需要在环境中存在持久性DNA。细菌经历转化的先决条件是其吸收游离的细胞外遗传物质的能力。这种细菌被称为感受态细胞。调节自然能力的因素在不同属之间有所不同。一旦转化因子(DNA)进入细胞质,如果它与细菌DNA不同,它可能会被核酸酶降解。如果外源性遗传物质与细菌DNA相似,它可能会整合到染色体中。有时,外源性遗传物质可以作为具有染色体DNA的质粒共存。

 

 用于转化的感受态细胞转化的原因

自然转化现象使细菌种群能够克服种群动态的巨大波动,而且能够克服在恶劣和极端环境变化期间维持种群数量的挑战。在这样的条件下,一些细菌属自发地将DNA从细胞释放到环境中而不被感受态细胞吸收。感受态细胞也响应环境的变化,通过自然转化过程控制基因获取的水平。

细菌转化示意图

图1:细菌转化示意图
 

 细菌的能力

并非所有细菌都能够从其环境中吸收外源DNA。获得感受态细胞的实际方法是使用化学物质或电脉冲使细菌细胞人为地获得能力。

  • 能力的化学诱导涉及以下步骤:
    • 在磷酸钙(货号:50552)存在下冷冻细胞,使其具有渗透性。
    • 与DNA一起孵育。
    • 在42°C下热休克处理60-120秒,导致DNA进入细胞。

说明:为了能够耐受热休克处理,所使用的细胞必须处于生长的对数期。

  • 或者,让细菌细胞在电脉冲下获得渗透性,这一过程称为电穿孔。

Sigma-Aldrich提供各种化学感受态细胞和电感受态细胞。请使用我们的选择指南选择适合您的产品。
 

 用于转化的感受态细胞的转化应用

转化现象已广泛应用于分子生物学。由于转化后的细菌很容易大量生长,因此它们在下列方面可以用作宿主细胞:

  • 制作DNA的多个拷贝
  • 克隆程序
  • 表达大量蛋白质和酶
  • 生成cDNA文库
  • DNA连接研究

 用于转化的感受态细胞的典型转化反应要求

  • 感受态细胞
  • 超螺旋质粒DNA
  • 转化培养基
  • 选择标记物(抗生素和/或生色底物)

所需材料和详细的转化实验方案可在此处找到。
 

 用于转化的感受态细胞的转化效率计算

转化效率定义为转化反应中使用的每μg超螺旋质粒DNA产生的转化体数量。

使用以下公式计算转化效率:
 

板上的菌落数(df)

X 1000 ng/µg

---------------------------

接种的DNA数量(ng)

 

 用于转化的感受态细胞中影响转化效率的因素

  • 用于转化反应的DNA
    • 必须仔细量化DNA的浓度,并且必须使用相同的DNA进行所有转化。由Sigma-Aldrich提供的pUC19 DNA(货号:D3404)被精确定量,适于维持转化反应中使用的质粒DNA的量。
    • 当使用<10ng DNA时,转化反应是有效的。pUC19 DNA(0.1ng)适合作为对照。
    • 与转化效率<1%的线性或ssDNA相比,超螺旋DNA对转化最有效。
    • 在电穿孔过程中,制备混合物中存在的盐可能降低转化效率。每次转化将质粒DNA的体积限制为1μL。
    • 柱纯化的DNA是最合适的,因为它没有干扰转化的污染物。
    • 每50μL反应物必须将miniprep DNA的体积限制在不超过5μL,以防止污染物降低转化效率。
    • 连接混合物抑制转化,因为连接酶抑制细胞的电穿孔。在将混合物加入细胞之前,必须将连接酶热灭活(65℃,5分钟)。
  • 热休克:最佳热休克设置如下:
    • 对于PCR管或薄壁管,42°C持续45秒
    • 对于微量离心管或厚壁管,37°C持续60秒
    • 一般设置:37°C持续60秒
  • 转化与接种之间的时间:
    随着转化反应与接种之间的时间增加,转化效率显著降低。然而,这也取决于菌株和所用的质粒。
  • 使用的微生物培养基:SOB培养基(货号:H8032)最适合转化,与LB培养基(货号:L2542L3522L3141)相比,化学感受态细胞的转化效率几乎提高了两倍。
  • 选择性板:具有选择剂的商业制备的琼脂板(货号:L5667L0168L0543L0418L8795)最适合鉴定转化菌落。接种大量细胞可能会产生不是真正转化体的卫星菌落。建议在选择性琼脂板上划擦菌落以鉴定真正的转化体。
  • 细胞的冻/融:重新冷冻和解冻的细胞的活性显著降低,导致转化效率降低至少两倍

 用于转化的感受态细胞中转化与转染的比较

 

转化 转染
适用于细菌 适用于真核细胞*
外源性遗传物质被感受态细菌吸收 外源性遗传物质被引入真核细胞
细菌可通过化学方法或电穿孔方法获得能力 通过电穿孔或使用病毒载体引入外源性遗传物质可以是脂质体介导的
外源性遗传物质可整合到细菌基因组中或作为质粒存在 外源性遗传物质可以整合到基因组中或被降解
转化能够表达DNA的多个拷贝,产生大量通常不被细菌表达的蛋白质或酶 转化的细菌的遗传物质可用于转染真核细胞进行DNA或蛋白质表达研究

* 由于增殖增加而发生细胞变化并变为恶性的真核细胞也称为“转化的”细胞。这种转化归因于基因、mRNA和/或蛋白质水平的失调,并且不像细菌中的转化。


 用于转化的感受态细胞的材料

 

应用 产品编号 产品说明 转化效率 基因型 蓝白筛选能力
用于蛋白质表达和DNA质粒产生 CMC0001 SIG10化学感受态细胞 ≥ 1 × 108 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) endA1 recA1 Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 araD139 Δ(ara,leu)7697 galU galK rpsL nupG λ- tonA
用于蛋白质表达和DNA质粒产生 CMC0002 SIG10 F化学感受态细胞 ≥ 5 × 108 [F´ pro A+B+ lacIqZΔM15::Tn10 (TetR)] /mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) endA1 recA1 Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK rpsL nupGλ tonA
用于蛋白质表达和DNA质粒产生 CMC0003 SIG10 HIGH电感受态细胞 ≥ 5 × 109 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) endA1 recA1 Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 araD139 Δ(ara,leu)7697galU galK rpsL nupG λ- tonA (StrR)
用于蛋白质表达和DNA质粒产生 CMC0004 SIG10 MAX电感受态细胞 ≥ 2 × 1010 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) endA1 recA1 Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 araD139 Δ(ara,leu)7697galU galK rpsL nupG λ- tonA (StrR) 
用于一般克隆和产生文库 CMC0005 SIG10 F' MAX电感受态细胞 ≥ 2 × 1010 [F´ pro A+B+ lacIqZΔM15::Tn10 (TetR)] /mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) endA1 recA1 Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK rpsL nupG λ- tonA (StrR) 
用于一般克隆和产生文库 CMC0006 SIG10 ULTRA电感受态细胞 ≥ 4 × 1010 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) endA1 recA1 Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 araD139 Δ(ara,leu)7697galU galK rpsL nupG λ- tonA (StrR) 
用于一般克隆和产生文库 CMC0007 SIG10 5a化学感受态细胞 ≥ 1 × 108 fhuA2Δ(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 Δ(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17
用于使用不稳定的DNA产生质粒 CMC0008 STEADY化学感受态细胞 > 1 × 107 recA13 supE44 ara-14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20(StrR) xyl-5 λ– leu mtl-1 F– mcrB mrr hsdS20(rB–, mB–)
用于使用不稳定的DNA产生质粒 CMC0009 STEADY电感受态细胞 > 1 × 107 recA13 supE44 ara-14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20(StrR) xyl-5 λ– leu mtl-1 F– mcrB mrr hsdS20(rB–, mB–)
用于制备诱变用的含尿嘧啶的DNA CMC0010 CHANGER电感受态细胞 1 × 109 [F’ Tra+ Pil+ (CamR)] ung-1 relA1 dut-1 thi-1 spoT1 mcrA
用于BAC和粘粒克隆 CMC0011 XLDNA V2电感受态细胞 ≥ 1 × 1010 F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) endA1 recA1 Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 araD139 Δ(ara,leu)7697 galUgalK rpsL nupG (attL araC-PBAD-trfA250 bla attR) λ-
用于BAC和粘粒克隆 CMC0012 XLDNA SIG10电感受态细胞 ≥ 1 × 1010 F - pro A+B+ lacIqZΔM15::Tn10 (TetR)] /mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) endA1 recA1 Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK rpsL nupG λ- tonA (StrR)
用于产生生物素化蛋白质 CMC0013 BIOTINYLATER F' 电感受态细胞 >1 ×1010 MC1061 [F´ pro A+B+ lacIqZΔM15::Tn10 (TetR)] araD139 ∆(ara-leu)7696 ∆(lac)l74 galU galK hsdR2(rΚ- mΚ+) mcrB1 rpsL (StrR) birA
用于蛋白质表达 CMC0014 BL21(DE3) 化学感受态细胞 ≥ 1 × 107 F – ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3)
用于蛋白质表达 CMC0015 BL21(DE3) pLysE化学感受态细胞 ≥ 1 × 107 F – ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3)
用于蛋白质表达 CMC0016 BL21(DE3) 电感受态细胞 ≥ 5 x 109 F – ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3)
用于最高蛋白质表达 CMC0017 OverExpress C41(DE3) 化学感受态细胞 ≥ 1 × 106 F – ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3) 
用于最高蛋白质表达 CMC0018 OverExpress C41(DE3) pLysS化学感受态细胞 ≥ 1 × 106 F – ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3) pLysS (CmR)
用于最高蛋白质表达 CMC0019 OverExpress C43(DE3) 化学感受态细胞 ≥ 1 × 106 F – ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3)
用于最高蛋白质表达 CMC0020 OverExpress C43(DE3) pLysS化学感受态细胞 ≥ 1 × 106 F – ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3) pLysS (CmR)
用于最高蛋白质表达 CMC0021 OverExpress C41(DE3) 电感受态细胞 ≥ 1 × 109 F – ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3)
用于最高蛋白质表达 CMC0022 OverExpress C43(DE3) 电感受态细胞 ≥ 1 × 109 F – ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3)
用于受控的蛋白质表达 CMC0023 CONTROLLER SIG10化学感受态细胞 > 1 × 109 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) endA1 recA1 ɸ80dlacZΔM15 ΔlacX74 araD139 Δ (ara,leu)7697 galU galK rpsL (StrR) nupG λ− tonA Mini-F lacIq1 (GentR)
用于受控的蛋白质表达 CMC0024 CONTROLLER BL21(DE3) 化学感受态细胞 > 1 × 107 F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3) Mini-F lacIq1(GentR)


 参考文献

  1. J Hyg (Lond). 1928 Jan;27(2):113-59. The Significance of Pneumococcal Types. Griffith F.
  2. J Exp Med. 1944 Feb 1;79(2):137-58. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of Pneumococcal types: induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from Pneumococcus type III. Avery OT, Macleod CM and McCarty M.

03/14-1