实验方案

产品编号:T9424

 操作程序

样品制备

1A. 组织:
在Polytron®或其他合适的均化器中将组织样品在TRI Reagent(每50-100mg组织1ml)中均化。

注释:如果需要最小量的DNA剪切,请使用松散型均质器,而不是Polytron(参见DNA分离,步骤3,注释b)。组织的体积不应超过TRI Reagent体积的10%。

1B. 单层细胞:
直接在培养皿上裂解细胞。每10 cm2玻璃培养板表面积使用1 ml TRI Reagent。加入试剂后,应使用移液管抽吸细胞裂解液数次,以形成均质裂解物。注释:TRI Reagent与塑料培养板"不"兼容。

1C. 悬浮细胞:
通过离心分离细胞,然后通过重复移液使其在TRI Reagent中裂解。1 ml试剂足以裂解5-10 × 106个动物、植物或酵母细胞或107个细菌细胞。

注释:
       a. 如果样品的脂肪、蛋白质、多糖或细胞外物质含量高,例如肌肉、脂肪组织和植物的块茎部分,则可能需要 额外的步骤。      均质化后,将匀浆以12,000×g、2-8℃离心10分钟以除去不溶物质(细胞外膜、多糖和高分子量 DNA)。上清液含有RNA和蛋白质。如果样品脂肪含量高,则应该除去水相表面上的一层脂肪物质。将澄 清的上清液转移到新管中并继续进行步骤2。按照DNA分离步骤2和3从沉淀中回收高分子量DNA。
        b. 一些酵母和细菌细胞可能需要均化器。
        c. 将细胞在TRI Reagen中均质化或裂解后,可将样品在-70℃下储存长达1个月。
 

2. 相分离:为确保核蛋白复合物完全解离,使样品在室温下静置5分钟。每ml所使用的TRI Reagent加入0.1ml 1溴-3氯丙烷或0.2ml氯仿(参见相分离,注释a和b)。紧紧盖住样品,剧烈摇动15秒,并在室温下静置2-15分钟。将所得混合物以12,000×g、2-8℃离心15分钟。离心将混合物分成3个相:红色有机相(含有蛋白质),中间相(含有DNA)和无色上层水相(含有RNA)。
 

注释:

       a. 1-溴-3-氯丙烷的毒性低于氯仿,用它进行相分离降低了DNA污染RNA的可能性。4
       b. 用于相分离的氯仿不得含有异戊醇或其他添加剂。
       c. 关于从水相中分离聚A+ 馏分的信息,请参见附录I。
 

 RNA分离

1. 将水相转移到新管中,每ml用于制备步骤1中的TRI Reagent加入0.5ml 2-丙醇,混合。让样品在室温下静置5-10分钟。在2-8℃下以12,000×g离心10分钟。RNA沉淀将在管的侧面和底部形成颗粒。

注释:将中间相和有机相储存在2-8°C,以备用于随后的DNA和蛋白质分离。

2. 去除上清液,在每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent中至少加入1ml 75%乙醇来洗涤RNA沉淀。涡旋样品,然后在2-8°C下以7,500×g离心5分钟。

注释:

      a.如果RNA颗粒漂浮,则以12,000×g在75%乙醇中洗涤。
      b.样品可以在2-8°C下在乙醇中储存至少1周,在-20°C下储存长达1年。

3. 通过风干或真空将RNA沉淀团短暂干燥5-10分钟。不要让RNA沉淀团完全干燥,否则会大大降低其溶解度。请勿在真空(Speed-Vac®)下离心干燥RNA沉淀团。向RNA沉淀团中加入适量的甲酰胺、水或0.5% SDS溶液。为了促进溶解,用微量移液管在55-60℃下重复移液10-15分钟以混合。
 

注释

    a. RNA的最终制备液中不含DNA和蛋白质。它应该具有≥1.7的A260 / A280比率。
    b. 组织的典型产率(mg RNA/mg组织):肝脏、脾脏:6-10mg;肾脏:3-4mg;骨骼肌、脑:1-1.5mg;胎 盘:1-4毫克。
    c. 培养细胞的典型产率(mg RNA/106细胞):上皮细胞:8-15mg;成纤维细胞:5-7mg。
    d. 琼脂糖凝胶中RNA的溴化乙锭染色显示两条主要条带:小(2 kb)和大(5 kb)核糖体RNA,
      低分子 量  0.1-0.3kb)RNA、以及高分子量(7-15 kb)RNA的离散条带。
 

 DNA分离

1. 小心地去除与中间相重叠的水相并丢弃。为了从中间相和有机相中沉淀DNA,在每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent中加入0.3ml 100%乙醇。用倒置的方法混合并在室温下静置2-3分钟。在2-8℃下以2,000×g离心5分钟。

注释:在DNA沉淀之前去除剩余的水相是保证分离DNA质量的关键步骤。

2. 去除上清液,保存在2-8°C,以备进行蛋白质分离。用0.1M柠檬酸三钠、10%乙醇溶液洗涤DNA沉淀团两次。对每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent使用1ml洗涤溶液。在每次洗涤期间,使DNA沉淀团静置(偶尔混合)至少30分钟。在2-8℃下以2,000×g离心5分钟。将DNA沉淀团重悬于75%乙醇(每ml TRI Reagent1.5-2ml)中,并在室温下静置10-20分钟。
 

注释
    a. 重要提示:请勿缩短样品处于洗涤液中的时间。30分钟绝对是从DNA中有效去除苯酚所需的最短时间。
    b.如果沉淀团含有> 200mg DNA或大量非DNA材料,则需要在0.1M柠檬酸三钠、10%乙醇溶液中额外洗涤。
    c.悬浮在75%乙醇中的样品可以在2-8℃下储存数月。

3. 在真空下将DNA沉淀团干燥5-10分钟,并溶解于8mM NaOH中,用微量移液管反复缓慢移液混合。加入足够的8mM NaOH,使最终DNA浓度为0.2-0.3mg / mL(对于从50-70mg组织或107个细胞中分离的DNA,通常为0.3-0.6ml)。这种温和的碱性溶液可确保DNA沉淀团完全溶解。以12,000×g离心10分钟,以除去任何不溶物质,并将上清液转移到新管中。
 

注释:
   
     a.  粘性上清液表明存在高分子量DNA。
     b.  DNA的大小取决于均质化过程中施加的力。避免使用Polytron均质器。
     c.  溶解在8mM NaOH中的样品可以在2-8℃下储存过夜。如要长期储存,则将pH值调节至7至8之间,并补 EDTA(最终浓度1 mM)。
     d.  要确定DNA浓度,取一份等分试样,用水稀释,并测量A260。对于双链DNA,1 A260单位/ml =50μg/ml
     e.  为了计算细胞数,假设人、大鼠和小鼠的106个二倍体细胞的DNA量分别等于7.1μg、6.5μg和5.8μg。
     f.  组织的典型产率(μg DNA/mg组织):肝脏、肾脏:3-4μg;骨骼肌、大脑和胎盘:2-3μg。
    g.  培养的人、大鼠和小鼠细胞的典型产率:5-7μg DNA/106细胞。
 

 用PCR扩增DNA

溶于8mM NaOH后,用HEPES调节至pH 8.4(加入86μL 0.1M HEPES 游离酸/ml DNA溶液)。将样品(通常0.1-1μg)加入PCR混合物中,并执行PCR实验方案。
 

 用限制酶消化DNA

用HEPES将DNA溶液的pH调节至限制酶消化所需的pH,或者针对1mM EDTA、pH 7-8透析样品。在最佳条件下使限制酶消化继续3-24小时。建议每1μg DNA使用3-5单位的酶。通常,80-90%的DNA被消化。
 

 蛋白质分离

1. 每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent,用1.5ml 2-丙醇,从苯酚-乙醇上清液(DNA分离,步骤2)沉淀蛋白质(参见注释)。使样品在室温下静默至少10分钟。在2-8℃下以12,000×g离心10分钟。

注释:对于某些样品,蛋白质沉淀团可能难以溶解在1% SDS(步骤3)中。使用下列步骤来解决这一问题:

        a.  在2-8℃下,更换3次0.1% SDS,每次透析苯酚-乙醇上清液。
        b.  在2-8℃下以10,000×g离心透析液10分钟。
        c.  澄清的上清液含有适用于西方蛋白质印迹程序的蛋白质。

2. 弃去上清液,并在0.3M盐酸胍 / 95%乙醇溶液中洗涤沉淀团3次,每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent用2ml洗涤溶液。在每次洗涤期间,室温下将样品在洗涤溶液中储存20分钟。在2-8℃下以7,500×g离心5分钟。洗涤3次后,加入2ml 100%乙醇,并涡旋蛋白质沉淀团。在室温下静置20分钟。在2-8℃下以7,500×g离心5分钟。

注释:悬浮在0.3 M盐酸胍 / 95%乙醇溶液或100%乙醇中的蛋白质样品可在2-8°C下储存1个月或在-20°C下储存1年。

3. 在真空下干燥蛋白质沉淀团5-10分钟。将沉淀团溶解在1% SDS中,将微量移液管吸头置于溶液中,移动柱塞帮助溶解。在2-8℃下以10,000×g离心10分钟,以除去任何不溶物质。将上清液转移到新管中。蛋白质溶液应立即用于西方蛋白印迹或储存在-20°C下。
 

 故障排除指南

1. RNA分离:

A. 低产率可能是由于:     

  • 样品未完全均质化或裂解。
  • 最终的RNA沉淀团可能尚未完全溶解。

B. 如果A260 / A280比率<1.65:
  • 用于均质化的样品量可能太小。
  • 均质化后,可能未让样品在室温下静置5分钟。
  • 水相可能污染有酚相。
  • 最终的RNA沉淀团可能尚未完全溶解。

C. 如果RNA降解:

  • 从动物身上取下组织后,可能没有立即处理或冷冻组织。
  • 用于分离的样品或者已分离的RNA制备液可能被储存于-20°C下,而不是操作程序规定的-70°C下。
  • 细胞可能已被胰蛋白酶消化而散开。
  • 用于操作的水溶液或试管可能含有RNAse。
  • 用于琼脂糖凝胶电泳的甲醛的pH值可能<3.5。
D. 如果有DNA污染:
  • 用于样品均质化的试剂量可能太小。
  • 用于分离的样品可能含有有机溶剂(乙醇、DMSO)、强缓冲液或碱性溶液。
     

2. DNA分离:

A. 低产率可能是由于:

  • 样品未完全均质化或裂解。
  • 最终的DNA沉淀团可能尚未完全溶解。

B. 如果A260 / A280比率<1.70:

  • 苯酚可能未从DNA制剂中充分除去。用0.1M柠檬酸三钠、10%乙醇溶液再洗一次DNA沉淀团。

C.如果DNA降解:

  • 从动物身上取下组织后,可能没有立即处理或冷冻组织。
  • 用于分离的样品可能被储存于-20°C下,而不是操作程序规定的-70°C下。
  • 样品可能是用Polytron或其他高速均质器均质化的。

D.如果有RNA污染:

  • 在有机相和中间相中可能存在过多水相。
  • DNA沉淀团可能未用0.1 M柠檬酸三钠、10%乙醇溶液充分洗涤。

3. 蛋白质分离:

A. 低产率可能是由于:

  • 样品未完全均质化或裂解。
  • 最终的蛋白质沉淀团可能尚未完全溶解。

B. 如果蛋白质降解:

  • 从动物身上取下组织后,可能没有立即处理或冷冻组织。

C. 如果PAGE显示条带变形:

  • 蛋白质沉淀团可能未经充分洗涤。

 附录

I.聚A+ RNA的分离
用2-丙醇沉淀RNA后(RNA分离,步骤1),将沉淀团溶解在聚A 结合缓冲液中,然后通过寡核苷酸dT纤维素柱,根据Aviv和Leder操作程序选择性地去除mRNA。

II.分离的RNA用于RT-PCR
1. 修改操作程序,即在初始样品制备步骤1B中进行额外的离心。注释c进一步减小了TRI Reagent LS提取的RNA中DNA污染的可能性。

2. 当RNA样品用于RT-PCR时,需要更完全地蒸发乙醇。这对于小体积样品(5-20​​μl)尤其重要,如果没有充分干燥,可能含有相对较多的乙醇。
 

 材料

     

TRI Reagent is a registed trademark of Molecular Research Center.
POLYTRON is a registered trademark of Kinematica AG.
SPEEDVAC is a registered trademark of Thermo Savant, Inc.