酶法测定尿素(苯丙氨酸测定)


 简介

该测定方案适用于通过尿素分析试剂盒(MAK006),比色检测细胞和组织培养上清液、尿液、血浆、血清和其他生物样品中的尿素含量。尿素浓度通过偶联酶测定法进行测定,其能够产生与样品中存在的尿素成比例的比色(570nm)产物。该测定的线性检测范围为1.0-5.0nmole。


 试剂

尿素测定缓冲液  25 mL                             25 mL
   货号MAK006A

过氧化物底物,溶于DMSO                        0.2 mL
   货号MAK006B

酶混合物                                                     1 vl
   货号MAK006C

显色剂                                                        1 vl
   货号MAK006D

转换酶                                                        1 vl
   货号MAK006E

尿素标准品,100 mM                                0.1 mL
   货号MAK006F


 所需的自备试剂和设备

96孔平底板 - 建议使用透明板进行比色分析(货号M4436或同类产品)。

分光光度多孔板读数器。


 准备说明

打开前,先将试剂管短暂离心。使用超纯水进行试剂制备。为了保持试剂的完整性,请避免反复冻/融循环操作。

尿素测定缓冲液 - 使用前让缓冲液平衡至室温。

过氧化物酶底物 - 使用前在室温下解冻至熔化的溶液。分装并在-20°C下避光和防潮储存。

酶混合物、显色剂和转化酶 - 使用220μL尿素测定缓冲液分别进行重溶。使用移液枪进行充分混合,然后等分并在避光,-20°C条件下储存。重溶后溶液请在2个月内使用,并在使用时保持冷藏。


 储存/稳定性

该试剂盒保存于湿冰上进行运输。建议在-20°C避光条件下储存。


 操作步骤

所有样品和标准品应设置重复实验。

用于比色检测的尿素标准品
用995μL尿素测定缓冲液稀释5μL100mM(100nmole /μL)得尿素标准溶液,以制备0.5mM(0.5nmole /μL)的标准溶液。将0、2、4、6、8和10μL的0.5mM尿素标准溶液加入至96孔板中,以设置0(空白)、1、2、3、4和5nmole /孔的标准品。向每个孔中加入尿素测定缓冲液,使终体积达到50μL。

样品制备
组织(20mg)或细胞(2×106)应在100μL冰尿素测定缓冲液中进行快速匀浆。在4℃下以13,000×g离心10分钟以除去不溶物质。

随后,可将血清和其他液体样品直接添加至孔中。

添加尿素测定缓冲液至样品中以达到终体积为50μL。

对于未知样品,建议测试几个样品的稀释液,以确保读数在标准曲线的线性范围内。

样品中存在的铵离子、NAD+/NADP+、和丙酮酸会产生背景信号。为了控制产生的背景信号,请通过省略反应混合物中的转换酶,为每个样品设置空白样品。
 

检测反应

  1.  根据表1中的方案设置反应混合物。每个反应(孔)需要50μL适当的反应混合物。

表1反应混合物

 

试剂 样品空白 样品和标准品
尿素测定缓冲液 44 µL 42 µL
过氧化物酶底物 2 µL 2 µL
酶混合物 2 µL 2 µL
显色剂 2 µL 2 µL
转换酶 - 2 µL


2.  向每个孔中加入50μL适当的反应混合物。使用水平振荡器或通过移液枪充分混合,并在37℃下孵育反应60分钟。在孵育期间需保证避光。

3.  测定在570nm处的吸光度(A570)。


 结果

计算

将0(空白)尿素标准品获得的吸光值设定为该测定的背景值。通过从所有读数中减去0(空白)得吸光值来进行背景校正。背景值十分重要,必须从所有读数中减去。使用从适当的尿素标准品所获得的吸光值绘制标准曲线。

注意:每次进行检测时都必须设置新的标准曲线。'

从样品读数中减去空白样品吸光值以获得校正后的测量值。使用校正后的测量值,可以从标准曲线中确定样品中存在的尿素含量。

尿素浓度

Sa = 来自标准曲线的未知样品中的苯丙氨酸(nmole)含量
Sv = 加入孔中的样品体积(μL)
C = 样品中尿素的浓度

尿素分子量:60.07g/mole。

样品计算

尿素量(Sa) = 4.84nmole
   (来自标准曲线)
样品体积(Sv) = 50 µL
样品中尿素的浓度

4.84 nmole/50 µL = 0.0968 nmole/µL

0.0968 nmole/µL x 60.07 ng/nmole= 5.81 ng/µL


 材料

     


 注意事项和免责声明

本产品仅用于研发用途,不可用于制药、家用或其他用途。有关危险和安全操作规程方面的信息,请参阅安全数据说明书。