Prestige Antibody®免疫印迹操作步骤

WB实验方案

建议根据下述标准WB实验方案使用Prestige Antibodies®进行免疫印迹分析。该免疫印迹标准实验方案针对以下应用优化:

 

电泳和免疫印迹

样品制备

将蛋白质样品(您所选择的组织裂解物、细胞裂解物或过表达裂解物)与Laemmli缓冲液(终浓度为2%SDS,10%甘油,0.002%溴酚蓝,0.0625 M TrisHCl)混合,补充DTT至终浓度为50 mM,并95°C孵育5分钟。

操作步骤

1.        将蛋白样品上样到预制凝胶上(4-20%聚丙烯酰胺)。电泳过程根据制造商提供的实验方案进行。

2.        通过半干转将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜上。

 

免疫检测

所有孵育和洗涤步骤均在室温和混摇条件下进行。

操作步骤

1.        将前述步骤干燥的膜在甲醇中活化20秒。为了防止一抗和/或二抗与膜非特异性背景结合,将膜在含有牛奶的封闭缓冲液(5%(5% (w/v)脱脂奶粉溶于含0.1% (v/v) Tween20的TBS中)中封闭45分钟。

2.        将一抗在封闭缓冲液中稀释,并与封闭后的膜一起孵育1小时。
:一抗的推荐工作稀释度仅作为参考。最佳稀释度必须由用户自己确定。

3.        为了除去残留的一抗,将膜在TBST(含有0.1% (v/v) Tween20的TBS)中洗涤3次,每次5分钟。

4.        将二抗(对于单克隆抗体:HRP偶联的山羊抗小鼠免疫球蛋白;对于多克隆抗体:HRP偶联的猪抗兔免疫球蛋白)在封闭缓冲液中1:3000稀释,并与膜一起孵育30分钟。

5.        为了去除残留的二抗,将膜在TBST中洗涤4次,每次5分钟。

6.        将膜与Immobilon Western化学发光HRP底物检测试剂一起孵育1分钟。

7.        使用CCD相机拍摄图像。

2017年10月修订

 

 

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