蛋白免疫印迹

蛋白印迹是指将蛋白质从十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳转印到PVDF或硝酸纤维素膜上,然后使用荧光或化学发光检测抗体对蛋白质进行免疫检测。单击下面的蛋白印迹实验方案的步骤,即可查看每个步骤的相关详细信息:
 

 膜转印(槽转印)实验方案

材料

 设置

  1. 制备足够的转印缓冲液注入转印槽,再加上额外的200 mL用以平衡凝胶和转印膜,并润湿滤纸。

  2. 从转印夹中取出凝胶,切掉积层胶和点样孔。

  3. 将凝胶浸泡在转印缓冲液中10至30分钟。

  4. 将滤纸浸泡在转印缓冲液中至少30秒。

  5. 准备转印膜:

        a. 如果使用PVDF转印膜,则将转印膜在甲醇中浸泡15秒。转印膜应均匀地从不透明变为半透明。
        b. 小心地将转印膜置于Milli-Q®水中浸泡2分钟。
        c. 小心地将转印膜置于转印缓冲液中,至少平衡5分钟。
     

 转印堆积层的组装

  1. 打开转印夹。

    重要提示:为了确保均匀转印,请在堆积层中每一层的表面小心滚动移液管或搅棒,以去除气泡。请勿太用力,以免损坏转印膜和凝胶。

  2. 将泡沫(纤维)垫放在卡盒的一侧。

  3. 将一张滤纸放在泡沫垫上。

  4. 将凝胶放在滤纸上。

  5. 将转印膜放在凝胶上。

  6. 将第二张滤纸放在堆积层上。

  7. 将第二个泡沫垫放在滤纸上。

  8. 盖上转印夹。
     

 蛋白质转印方法(槽转印)

  1. 将转印夹放入转印槽中,让凝胶一侧面对阴极(-),膜一侧面对阳极(+)。

  2. 在槽内加入足够量的缓冲液,以覆盖转印夹。

  3. 将黑色阴极引线(-)插入转印装置的阴极插孔,将红色阳极引线(+)插入阳极插孔。

  4. 将阴极引线和阳极引线连接到相应的电源输出。

  5. 如果有的话,根据制造商的说明设置转印装置的冷却装置。

  6. 开启系统,以6-8 V/cm极间距离运行1-2小时。有关优化的详细信息,请查看转印槽制造商的指南。

  7. 在转印完成后,从转印槽中取出转印夹。

  8. 用镊子小心地分开转印堆积层。
     

 成功进行蛋白印迹转印的提示

 

提示:在两种类型的转印系统(槽式和半干式)中,应特别注意防止在滤纸、凝胶或转印膜之间的任何地方引入气泡。
提示:以恒定电流转印蛋白质。如果以恒定电压转印,则请监控电流以确保其不超过0.4安培。从100 V开始,如果电流过高则降低电压。
提示:Immobilon® 转印膜的两面同样有效。任一侧的外观(无论是有光泽还是暗淡)对转印膜的转印和检测效率都没有影响。
提示:对于含有小肽的样品,对转印缓冲液中凝胶的平衡应限制在10分钟以内。
提示:凝胶可以单层转印,也可以以一个堆积层转印多层。

 

 半干膜转印实验方案

材料

 设置

  1. 制备阳极缓冲液,每份各200 mL,以及400 mL阴极缓冲液。

  2. 从转印夹中取出凝胶,切掉积层胶和点样孔。

  3. 将凝胶浸泡在200mL阴极缓冲液中15分钟。

  4. 将两张滤纸浸泡在阳极缓冲液 I 中至少30秒。

  5. 将一张滤纸浸泡在阳极缓冲液 II 中至少30秒。

  6. 将三张滤纸浸泡在阴极缓冲液中至少30秒。

  7. 准备转印膜:

        a. 将转印膜在甲醇中浸泡15秒。转印膜应均匀地从不透明变成半透明。

        b. 小心地将转印膜置于Milli-Q®水中浸泡2分钟。

        c. 小心地将转印膜置于阳极缓冲液 II 中,至少平衡5分钟。
     

 单层转印:

  1. 将阳极电极板放在水平台面上。

  2. 将两张浸泡过阳极缓冲液 I 的滤纸放在电极板中央。

  3. 将那张浸泡过阳极缓冲液 II 的滤纸放在前两张上面。

  4. 将转印膜放在滤纸上面。

  5. 将凝胶放在膜上面。

  6. 将三张浸泡过阴极缓冲液的滤纸放在凝胶上面。

  7. 将阴极电极板放在堆积层的最上面。

 多层转印:

  1. 将阳极电极板放在水平台面上。

  2. 将两张浸泡过阳极缓冲液 I 的滤纸放在电极板中央。

  3. 将那张浸泡过阳极缓冲液 II 的滤纸放在前两张上面。

  4. 将转印膜放在滤纸上面。

  5. 将凝胶放在膜上面。
    如果是最后一块凝胶,请转到第10步。

  6. 将一张浸泡过阴极缓冲液的滤纸放在凝胶上面。

  7. 将一张透析膜放在滤纸上面。

  8. 将一张浸泡过阳极缓冲液 II 的滤纸放在透析膜上面。

  9. 重复第4-8步,直到所有凝胶(设备允许的最大数量)都放入堆积层中。

  10. 将三张浸泡过阴极缓冲液的滤纸放在膜上面。

  11. 将阴极电极板放在堆积层的最上面。

    重要提示:在运行过程中切勿碰撞阴极板盖,否则会影响转印堆积层的对齐,使结果不准确。

 蛋白质转印方法(半干转印)

  1. 将黑色阴极引线(-)插入阴极板插孔。

  2. 将红色阳极引线(+)插入阳极板插孔。

  3. 将阴极引线和阳极引线连接到相应的电源输出。

  4. 打开电源开关。

  5. 设定电流,按下表中显示的时间运行:
     

  6. 电流密度 时间限制
    0.8 mA/cm2* 1-2小时
    1.2 mA/cm2 1小时
    2.5 mA/cm2 30-45分钟
    4.0 mA/cm2 10-30分钟

* 表面积(cm2)是根据阳极板上堆积层表面尺寸计算的。该数值与堆积层中的凝胶片张数无关。
 

 传统的免疫检测

所需设备

        * 摇床和浅托盘仅用于传统的免疫检测;对于用SNAPi.d.® 系统进行真空驱动的快速免疫检测,请参见SNAP i.d.® 免疫检测实验方案

 抗体孵育

  1. 将印迹置于封闭溶液中,摇动孵育1小时。

  2. 将印迹放入单克隆抗β-肌动蛋白抗体一抗溶液中,例如,摇动孵育1小时。溶液应在膜表面自由移动。

  3. 将印迹放入PBS中,清洗10分钟。用新鲜的缓冲液重复两次。

  4. 将印迹放入二抗溶液,在室温或37°C摇动孵育1小时。

  5. 将印迹放入PBS中,清洗10分钟。用新鲜的缓冲液重复两次。

  6. 继续进行显色、化学发光或荧光检测。还请查阅蛋白质检测的相关资源::

      蛋白质的显色和化学发光检测

    使用BCIP / NBT底物进行免疫检测
     

搜索蛋白印迹测试抗体(Western Blot Tested Antibodies)

 


搜索结果过滤条件:



 

 

 化学发光检测

请按照制造商的说明进行。

  1. 根据制造商的说明准备底物。

  2. 将印迹放入容器,加入底物以完全覆盖膜。
    孵育1分钟。

  3. 排出多余的底物。

  4. 将印迹放在干净的玻璃上,用保鲜膜包好。

    说明:
    也可以使用按尺寸切割的保护片或冷冻袋。

  5. 轻轻按压排出任何气泡。

  6. 在暗室中,将包裹好的膜放入暗盒中。

  7. 将一张放射自显影胶片放在上面并关闭暗盒。

  8. 曝光胶片。应进行15秒至30分钟的多次曝光,以确定最佳曝光时间,1至5分钟是常用时间。
     

 荧光检测

所需设备 

以下是荧光免疫检测的一般实验方案。为获得最佳结果,请参阅制造商随试剂提供的实验方案。

说明:如果使用化学荧光试剂,请遵循试剂制造商的说明。

  1. 将印迹置于稀释的荧光染料标记的二抗溶液中,并温和摇动孵育1小时。

  2. 用洗涤缓冲液洗涤印迹3-5次,每次5分钟。

  3. 将印迹放在一张干净的滤纸上晾干。

  4. 如果使用保鲜膜,请使用Mylar®。请勿用Saran™保鲜膜,因为它透光而使荧光失效。

  5. 使用适当的荧光扫描仪对印迹进行成像。
     

 蛋白印迹故障排除指南

 

由于老化或储存不当,底物或缀合物弱或不再有活性。

问题 可能原因 解决方案
无信号或信号弱,或出现非特异性条带 测试缀合物和底物的活性。例如,将酶缀合物添加到底物溶液中。它应该变色。
  如果是使用化学发光检测,胶片显影溶液可能已经过期。 使用新鲜的胶片显影溶液。
  使用的底物不正确。 确保所选的底物适合酶缀合物。
  底物准备不正确。 请按照随底物提供的说明进行。如有必要,确保添加新鲜的H2O2
  一抗或二抗稀释不正确。 请查阅相关文献或数据表,以了解所用抗体的推荐稀释度。尝试一系列稀释。更多并不总是更好,特别是对化学发光等敏感检测系统尤为如此。大多数Sigma的抗体都使用不那么敏感的比色底物进行了测试。因此,如果使用化学发光检测,抗体可能需要再多稀释5-10倍。
  应用中使用的一抗不正确。 确保抗体已被证明可用于免疫印迹。并非所有抗体都适用于所有应用。一抗可能不能与所研究的物种的目标蛋白质反应。请查阅相关文献 / 数据表和蛋白质序列信息。
  目标蛋白质不存在或存在量很低。 如果阳性对照有反应,请检查蛋白质的上样量。如有必要,尝试通过免疫沉淀或纯化来富集加载的样品中目标蛋白质的量。

请查阅相关文献,了解目标蛋白质的最佳来源。请参见下文“蛋白质转印不良”部分。
  应用中使用的二抗不当。 二抗可能不能结合一抗。在一小块膜上点上一点一抗进行测试。当斑点干燥后,封闭,然后用探针混入稀释的二抗,洗涤并用底物显色。如果二抗结合到一抗,则会显现斑点。
  孵育时间不足。 用一抗孵育至少一小时。
  存在酶抑制剂。 叠氮化钠抑制过氧化物酶反应。
  过度洗涤。 缩短洗涤时间,洗涤缓冲液中别加去垢剂。
  蛋白质转印不良。 封闭前,用Ponceau S(产品编号:P7170)对膜染色,以检查蛋白质向膜的转印情况。确保膜在转印前已均匀润湿。测试转印时间。小蛋白质(<10,000)可能透过了转印膜(尝试在第一张膜后再加一层膜)。较大的蛋白质可能需要较长的转印时间。检查转印缓冲液—高浓度甲醇可能会阻止蛋白质从凝胶转印。转印缓冲液含有0.005-0.01%的SDS可以增加蛋白质从凝胶的转印,但它也可以干扰蛋白质与膜的结合。如果蛋白质的pI> 9.0,尝试使用CAPS,pH 9作为转印缓冲液。
背景高或出现非特异性条带 封闭不足。 尝试其他封闭策略:更长的封闭时间,更高的封闭试剂浓度,不同的封闭试剂,在抗体稀释液中包含封闭蛋白或尝试新批次的同一种封闭试剂。
  一抗可能不够特异性。 尝试单克隆或亲和纯化的多克隆抗体。
  一抗浓度高。 查阅相关文献或数据表,以了解一抗的推荐稀释度。尝试一系列稀释以优化您的系统。
  二抗浓度高。 运行额外的样品泳道并省去程序中的一抗孵育,以测试这一点。如果这种“只有二抗”的对照导致非特异性染色,则尝试进一步稀释二抗或尝试另一种二抗。
  二抗与样品中的其他蛋白质交叉反应。 用含有来自样品同一物种的1-5%正常血清的缓冲液稀释二抗。
  多个条带可能是目标蛋白质的蛋白水解片段。 确保从样品制备的第一步开始就存在蛋白酶抑制剂。正确储存和操作样品制剂以减少蛋白质水解的机会。尽可能用新鲜的样品。
  抗体孵育时间超过必要时间。 缩短孵育时间。
  比色底物溶液孵育过度。 缩短染色时间。将膜暴露于基质直至看到正信号。在背景发展之前通过洗涤转印膜来停止反应。
  洗涤不足。 增加洗涤次数或强度。
  样品中存在污染酶。 只用底物测试样品,以检测查蛋白质样品中的污染酶活性。

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