FFPE 组织

存档的福尔马林固定和石蜡包埋 (FFPE) 组织样本是分析基因表达和研究多种疾病的宝贵资源。由于存档的 DNA 通常数量有限,因此样本的扩增必不可少。由于存档过程导致模板损坏,放大 FFPE 组织可能是一项艰巨的任务。该方案为从 FFPE 组织中纯化和扩增基因组 DNA 提供了方便的方法。GenomePlex® 全基因组扩增已用于扩增大鼠和人类 FFPE 组织样本的基因组 DNA。

注:以方案描述了 DNA 纯化和随后的全基因组扩增的过程。我们用 GenomePlex 组织全基因组扩增试剂盒(产品编号    WGA2  +  C4482 )。该试剂盒包括用于组织破碎和细胞裂解的优化试剂,无需繁琐的有机提取过程,可在扩增前去除多余的石蜡或 DNA 纯化过程。有关   WGA2  +   C4482   扩增方案的详细信息,请参阅直接从存档组织进行的全基因组扩增。


 由用户提供的材料

从福尔马林固定和石蜡包埋 (FFPE) 组织中提取 DNA
该方案在大鼠肝组织上进行。建议于此过程使用  GenElute 哺乳动物基因组 DNA 小量制备试剂盒(产品编号:G1N10)

  1. 将一小段 (20 mg) 石蜡包埋组织放入 2 mL 微量离心管中。
  2. 加入 1200μl 二甲苯,涡旋 30 秒。
  3. 室温全速离心 5 min。
  4. 移液除去上清液。切勿取出任何颗粒。
  5. 向沉淀中加入 1200μl 乙醇以除去残留的二甲苯。涡旋混匀。
  6. 室温全速离心 5 min。
  7. 小心移液除去乙醇。切勿取出任何颗粒。
  8. 再次重复步骤 5-7。
  9. 将开放的微量离心管在 37°C 培养 10-15 min,通过蒸发除去任何残留的乙醇。
  10. 消化组织:将组织块重悬于 180μl 裂解液 T 中。
  11. 加入 20μl 蛋白酶 K。通过涡旋混合。在 55 °C 下培养过夜或直至组织完全裂解。培养期间偶尔涡旋。    
    可选RNase处理:如果担心残留 RNA,加入 20μl 的RNase A 溶液,室温培养 2 min。
  12. 裂解细胞:涡旋 15 秒。向样品中加入 200μl 裂解液 C。对于均匀混合物的彻底涡旋对于有效裂解是必不可少的。在 70 °C 下培养 10 min。  
  13. 准备色谱柱:向每个预装 GenElute 微量提取吸附柱中加入 500μl 柱制备液,12,000×  g  离心 1 min。
  14. 结合准备:向裂解的样品中加入 200μl 乙醇,涡旋混匀。
  15. 加裂解液:从步骤 14 开始将样品管的全部内容物转移到处理过的吸附柱中。以≥6500×  g  离心 1 min。弃去含有流通液的收集管,将吸附柱置于新的 2 mL 收集管中。
  16. 第一次清洗:首次使用前,请按照配制说明书的说明用乙醇稀释洗涤液浓缩液。向吸附柱中加入 500μl 洗涤液,在≥6,500×  g 离心 1 min。弃去含流通液的收集管,将吸附柱置于新的 2 mL 收集管中。
  17. 第二次洗涤:向吸附柱中再加入 500μl 洗涤液,并以最大速度离心 3 min (12,000–18,000×  g) 以干燥吸附柱。在洗脱柱上的 DNA 之前,吸附柱不含乙醇至关重要。如果看到残留乙醇,将吸附柱再离心一分钟。弃去含有流通液的收集管,将吸附柱置于新的 2 mL 收集管中。
  18. 洗脱 DNA:将 200μl 洗脱液直接移入吸附柱中心,室温培养 5 min。以 ≥6500×  g  离心 1 min 以洗脱 DNA。
  19. 将 DNA 样品储存在 –20°C。
    注:从第 10 步开始,无需使用二甲苯即可执行此方案。由于省略了二甲苯处理步骤,与采用二甲苯步骤的方案相比,DNA 的量将减少约 50%。


 应用数据

GenomePlex 全基因组扩增 FFPE 组织

 

使用来自我们、供应商 A 和供应商 Q 的    GenomePlex 全基因组扩增试剂盒

 

图例说明:使用来自我们、供应商 A 和供应商 Q 的    GenomePlex 全基因组扩增试剂盒(产品编号:WGA1)  ,产品在 1.5% 琼脂糖凝胶上分离。在每个孔中加入 5μl 扩增产物。与供应商 A 和 Q 相比,使用 GenomePlex 技术扩增的产物分子量较小,这归因于扩增前基因组 DNA 的随机片段化。我们的扩增产物是特异性的,在阴性对照中没有可见的扩增子(泳道 2),表明只有所需的基因组 DNA 被扩增。供应商 A 和 Q 在阴性对照中产生非特异性信号,其大小和强度与供应商阳性对照的信号相等。

 

泳道 1—1kb 标记 泳道 6—供应商 A 10 ng 输入 DNA
泳道2—我们的阴性对照 泳道7—供应商 A 100 ng 输入 DNA
泳道3—我们的 10 ng 输入 DNA 泳道8—供应商 Q 阴性对照
泳道4—我们的 100 ng 输入 DNA 泳道9—供应商 Q 10 ng 输入 DNA
泳道5—供应商 A 阴性对照 泳道10—供应商 Q 100 ng 输入 DNA

 

从福尔马林固定和石蜡包埋的大鼠肝脏样本中提取 DNA。

 

图例说明:从福尔马林固定和石蜡包埋的大鼠肝脏样本中提取 DNA。使用     GenomePlex Complete WGA 试剂盒(产品编号:WGA2)  ,然后使用     GenElute PCR Clean-up Kit(产品编号:NA1020).使用 12 种不同的引物组对 WGA 反应进行定量 PCR(45 个循环)。与供应商相比,GenomePlex 表现出约 1000 倍 (10 Ct) 更好的代表性。


 材料