完整全转录组扩增试剂盒实验方案 (WTA2)

产品描述

WTA2(一种全转录组扩增(WTA)方法)能够在区区4小时内,代表性地扩增出纳克级的总RNA而没有3'偏差。从组织、培养细胞、福尔马林固定样品或血清中所获得的微克级产物适用于例如qPCR和微阵列分析等下游应用。完整WTA试剂盒提供扩增所需的所有试剂,也包括扩增酶。

 WTA实验过程包括两个步骤。在第一步中,用由半简并3'末端和通用5'末端组成的引物逆转录样品RNA。随着聚合反应的进行,置换的单链可用作引物退火和延伸的新模板。 然后用通用引物通过PCR扩增得到的cDNA文库(其由侧翼为通用末端序列的随机重叠片段组成),以获得WTA产物。当扩增完整RNA时,产物大小范围为100-1000个碱基,对于降解的RNA来说,其大小通常会更小。

 

组分


描述 货号 10 RXN 50 RXN
文库合成缓冲液 L9418 25 µL 125 µL
文库合成溶液 L9293 25 µL 125 µL
文库合成酶 L9543 20 µL 100 µL
扩增混合液 A6731 375 µL 1.875 µL
10 mM dNTP混合液 D7295 0.2 mL 0.5 mL
无核酸酶水 W4502 5 mL 20 mL
扩增酶 A6856 37.5 µL 187.5 µL


 

存储/稳定性

所有组分应储存在-20°C条件下。解冻使用时,所有组分应保存在冰上。如果储存温度高于-20°C 或在4°C以上放置较长时间,则WTA文库合成酶的稳定性会受到影响。 RNA样品(不包括在试剂盒内)应放置于冰上进行解冻。

 

操作步骤

按照此实验步骤进行操作,研究人员可以从5-25 ng高质量总RNA中生产得到25-40 µg WTA扩增产物。通常,当从FFPE组织中进行分离时,推荐加入5至10倍的RNA量。反应可以按比例放大或缩小以适应所需数量的最终产品的制备。

文库合成反应

1. 解冻文库合成缓冲液、文库合成溶液。文库合成酶以及无核酸酶水。将文库合成缓冲液和文库合成溶液充分混合。通过在37℃条件下短暂加热并充分混合,以溶解溶液中的任何可能沉淀物。

2. 于至少25 ng总RNA(每75μL反应5 ng,步骤10)中添加:

     a. 2.5μL文库合成溶液

     b. 无核酸酶水至总体积为16.6μL

:建议在每375μL反应(50 ng/75μL反应,步骤10)中,至少加入250 ng 降解的总RNA(例如来自FFPE组织中的RNA)。

3. 混匀,并在热循环仪中70℃孵育5分钟,然后在18℃下孵育。

4. 向冷却的引物结合后的RNA中立即添加(单独或预混):

    a. 2.5 µL文库合成缓冲液

    b. 3.9 µL水

    c. 2 µL文库合成酶

5.使用以下参数在热循环仪中进行孵育:

     18ºC,10分钟

     25ºC,10分钟

     37ºC,30分钟

     42ºC,10分钟

     70ºC,20分钟

     4ºC

6. 通过离心和混合来合并冷凝的部分。


扩增反应

7.解冻扩增混合液和10 mM dNTP混合液。

8.准备以下预混液

    a. 301μL无核酸酶水

    b. 37.5μL扩增混合液

    c. 7.5μL WTA dNTP混合液

    d. 3.75μL扩增酶

:对于实时PCR,应从水体积中扣除参比染料的体积和3.75μL的SYBR®Green染色剂1:1000稀释液(于无核酸酶水中稀释)。应在分别加入之前立即将SYBR®Green稀释液添加至主混合液中。请为每个实验准备新配置的稀释液。

9. 将步骤6(25μL)的整个文库合成反应添加至步骤8的主混合溶液中,并混合。

10. 将上述(步骤9)反应液分为五个75μL反应(对于最后一个等分试样,反应体积<75μL并没有关系)。使用以下参数在热循环仪中进行孵育:

    94 ºC,2分钟。

    94 ºC,30秒,70 ºC ,5分钟(17个循环)

:最佳扩增循环数随模板数量和质量而变化。对于5 ng高质量RNA或50 ng FFPE RNA,建议使用17个循环。由于降解水平的变化(例如,从FFPE组织分离的RNA),一些RNA样品可能需要更高的输入量和/或更多的循环。在实时定量PCR中,可通过设置超出扩增“平台”区域2-3个循环来实现最佳循环数。

11. 循环完成后,将反应保持在4°C或储存在-20°C,直到准备好进行下一步的分析或纯化。WTA DNA的稳定性与在相同条件下储存的基因组DNA一样。

12. 为了去除残留的引物和核苷酸,可使用任何标准PCR纯化试剂盒或等效方法对双链和单链DNA进行纯化。

13. 通过测定吸光度来定量纯化的DNA。 1 个A260 单位相当于50 ng /μL DNA。由于扩增后可能存在单链DNA,因此若使用PicoGreen® 染料的测定技术通常会低估实际的WTA DNA产量。

 

PicoGreen和SYBR均为Molecular Probes公司的注册商标

故障排除指南


现象 可能原因 建议解决方法
产量低 样品RNA质量(降解或不纯) 对所加入的RNA量进行滴定(最高至300 ng)
评估不同的RNA制备方法

增加PCR循环数

在实时仪器中对扩增进行监控,以确定最佳PCR循环数
将多个降解或不纯样品的反应产物混合
使用PicoGreen进行定量 通过UV吸光度确定产率
没有纯化单链或小片段产物 使用纯化双链和单链DNA的试剂盒
使用能够纯化100 bp PCR产物的试剂盒
罕见的转录本在文库扩增过程中没有有效地掺入 RNA加入量不足 增加RNA数量


 

常问问题

可以使用哪种类型的RNA?

可以使用标准方法或试剂盒对RNA进行分离; 可以使用来自多种来源材料的RNA,包括血液、组织活检、培养的细胞和固定或冷冻组织。也可以使用非人源RNA,例如动物、植物或微生物。

 

成功进行WTA扩增需要多少RNA?

为了获得最强大的性能,应有浓度> 5 ng /μl(溶于TE缓冲液中)至少50 ng的RNA,浓度 <5 ng的RNA样本是不可用的。RNA可以是单链或双链的,并且应具有至少300个碱基。

 

如何优化扩增产量?

最佳PCR循环数可能随模板数量和质量而变化。对于5 ng高质量RNA的等分试样,推荐17个循环。如果使用实时系统,则将最佳循环数定义为2-3个循环的“平台期”的最后一个循环,在此阶段相对荧光单位保持恒定。

 

一旦文库扩增完成,样品应该如何纯化?

完成文库扩增后,应纯化cDNA以除去可能干扰下游应用的残留引物和核苷酸。我们推荐使用Sigma-Aldrich®GenElutePCR DNA纯化试剂盒(NA1020)从其他反应成分(如过量引物、核苷酸或聚合酶)中纯化出单链和/或双链扩增产物。

 

WTA2可用于扩增档案固定组织或降解样本吗?

可以,WTA试剂盒可有效扩增降解的RNA,包括福尔马林固定和石蜡包埋的样品。然而,为了可接受地扩增最终产品,降解的样品需要使用更多的起始材料,但应不超过300 ng。

 

WGA2试剂盒提供哪些材料?

WGA2为第一链合成、第二链合成和cDNA文库扩增提供了所有必需的缓冲液、引物和酶。

 

我需要量化我的WTA产物,首选方法是什么?

应使用UV吸光度(A260)以1 OD =50μg/ ml的转化率来定量纯化的产物。PicoGreen®不能用于定量,因为它不能有效检测单链产物,从而会低估DNA产量。从高质量人类总RNA产生的每个等分试样文库将产生4至8μg的WTA产物。如果进行电泳,产物在0.8%琼脂糖凝胶上显示为尺寸分布为0.2 kb至2 kb的拖尾。产物的产量和大小分布会随样品RNA的完整性和纯度而变化。

 

WTA产品的下游应用是什么?

WTA扩增可以产生RNA模板的cDNA文库。可以进行诸如qPCR、传统克隆(TOPOTACloning®)、微阵列等的应用。

 

WTA2系统是否具有3'引物偏倚?

没有,该系统使用通用末端的准随机WTA引物进行cDNA产物的合成。这使得其能够扩增高度降解的RNA,其中许多可扩增的序列已经与poly-A序列分离。对于降解的和完整RNA(与3'偏倚方法进行比较)的qPCR和微阵列测试已经成功。

 

我可以在我的靶序列中设计我的qPCR引物吗?

WTA2系统的扩增反应是随机引发的,因此可以在mRNA内的任何位置进行引物设计。为了避免可能的基因组DNA污染造成的qPCR干扰,我们建议用DNA酶处理您的RNA并设计跨越内含子的扩增子。由于起始FFPE RNA可能会高度降解,因此我们强烈建议您在整个转录本中设计多个扩增位点。

 

我可以调整实验方案吗?

可以,该实验方案是被优化以产生用于微阵列分析的微克级cDNA。缩小反应体积不会影响结果的质量,只会影响最终产物的数量。

 

我想克隆cDNA文库 - 有什么建议吗?

cDNA产物与其他任何PCR产物相似。建议使用TOPO TA克隆法。确保设置合适的稀释度以获得最佳克隆结果。

 

材料