酵母转化实验方案

分子生物学指南中可以找到更多的实验方案和选择指南。


 引言

酵母生长迅速且细胞分散,因此被认为是真核研究的模型系统。此外,酵母细胞的复制接种和突变体分离相对容易,并且它们具有明确定义的遗传系统。最重要的是,酵母具有高度通用的DNA转化系统,可有效地用于蛋白质生产。


 酵母转化

表4:Sigma-Aldrich酵母转化产品
 

货号 描述 应用 特点 / 优点
YEAST1 酵母转化试剂盒,该产品包含:
• 10μg对照酵母质粒DNA,pRS316
• 100mL 接种缓冲液
• 100mL转化缓冲液
适用于转化任何酵母菌株。方便、灵活、灵敏,用少至10ng的DNA即可获得阳性转化体;最佳效率在0.1-3μg范围内。 - 简单易用,而且是即用型
- 只需要少至10ng的质粒DNA
- 可灵活用于任何酵母菌株 — 足以进行100次标准转化
L4158 乙酸锂二水合物 促进酵母转染 BioXtra产品系列的一部分
T9285 Tris-EDTA缓冲溶液(TE缓冲液)含有1M Tris-HCl(pH ~8.0)以及0.1M EDTA。 TE(Tris EDTA)缓冲液通常用于分子生物学实验室。TE溶解DNA和RNA,同时保护其免于降解。 适用于RNA和DNA的储存,包括纯化的质粒DNA原液。
D8418 二甲亚砜(DMSO)   可用于制备用于下列应用的缓冲液:转化,DEAE-葡聚糖介导的细胞转染,用40-50%PEG进行的细胞融合程序,以及其他一些应用。 - 该产品可以将转化效率提高2到5倍
- 该产品不含DNases、RNases、磷酸酶和蛋白酶。
D9156 脱氧核糖核酸(DNA),单链,来自鲑鱼睾丸   可用于酵母转化。   该DNA用乙醇沉淀,并经超声处理,以产生单链片段,这些片段与587和831碱基对标记片段共迁移。


 酵母转化实验方案

实验方案概述

LiAc转化方法涉及三个主要步骤:制备感受态酵母细胞,用质粒DNA转化,然后接种以选择转化体。通常使用营养缺陷型标记来选择酵母转化体;因此选用合适的营养缺陷型合成培养基来筛选转化体。

所需试剂:

原液:
50%聚乙二醇溶液(摩尔重量~36,500)
1M Tris-HCl和0.2M EDTA,pH 8.0(TE缓冲液)(货号:T9285
1M醋酸锂,pH 7.5(货号:L4158

1x TE-LiAc溶液
10mM Tris-HCl,pH 8.0,含1mM EDTA和0.1M乙酸锂

PEG-TE-LiAc溶液
40%PEG 10mM Tris-HCl溶液,pH 8.0,含1mM EDTA和0.1M乙酸锂

酵母转化

  1. 准备YPD以及合成完全(SC)营养缺陷型培养基培养板,并分别高压灭菌(参见表1和2了解Sigma-Aldrich产品,并参阅“酵母培养基链接”了解培养基制​​备详情)。
  2. 将酵母细胞从培养板接种到100mL无菌烧瓶中的20mL YPD培养基中。
  3. 摇晃培养过夜。
  4. 将来自上述培养物的细胞稀释到100mL YPD培养基中,直至OD600为0.3。
  5. 温和地沉淀细胞。
  6. 重悬于7-8mL的1x TE-LiAc溶液中,并在23℃下旋转1-1.5小时。
  7. 将10μL 10mg/ ml鲑鱼睾丸DNA(货号:D9156)添加到指定用于转化的若干无菌微量离心管中,将其中一个管作为阴性对照。
  8. 将0.1μg酵母质粒DNA(拟将研究的)加入每个试管中,再将100μL感受态细胞加入每个试管中,然后涡旋。
  9. 加入600μL新鲜制备的PEG-TE-LiAc溶液,涡旋,并在30℃下振动孵育30分钟。
  10. 可选步骤 — 可将DMSO(货号:D8418)添加至10%(v / v);然后在42℃下热激15分钟。
  11. 旋转3秒,将细胞重悬于无菌水中,然后接种于适当的SC营养缺陷型培养基中。

说明:关于酵母接种以及下节酵母转化体分离的详细说明,请参阅相关培养实验方案。

分离酵母转化体

尽管也可以使用氨基酸互补法和蓝白斑筛选法,但通常使用URA3互补方法选择酵母转化体。

在基于URA3的选择技术中,质粒DNA具有酵母URA3基因的正常拷贝和URA3启动子;而酵母突变株却缺乏URA3等位基因。因此,用质粒转化的酵母细胞具有URA3基因的功能性拷贝,这使得它们能够在不含尿嘧啶(货号:Y1501)的酵母合成营养缺陷型培养基补剂上生长。

图1:酵母转化

酵母转化


 材料

     


 参考文献

  1. Sherman, F., Getting started with yeast, Methods Enzymol., 350, 3-41 (2002).
  2. Methods in Molecular Biology, Vol. 177, Two-Hybrid Systems: Methods and Protocols, May 2001, Springer Protocols
  3. Current Protocols in Molecular Biology 13.2.1-13.2.12, April 2008, Wiley Interscience
  4. Schiestl and Gietz (1989) Curr. Genetics 16:339-346; Gietz, et al (1995) Yeast 11:355-360
  5. Li, B., and Fields, S., Identification of mutations in p53 that affect its binding to SV40 large T antigen by using the yeast two-hybrid system. The FASEB journal, 7(10), 957-963 (1993).

EZMix是Sigma-Aldrich Co. LLC.的商标。

Parafilm是Bemis Company, Inc.的注册商标。

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