Duolink®在线研讨会

Duolink及PLA技术介绍 - 2015年3月10日

研究生物通路的研究人员需要更高的灵敏度来发现疾病生物标志物。Duolink使用PLA技术与有效的抗体结合后,通过对内源蛋白质进行简单而灵敏的原位检测,能够实现优于免疫共沉淀(co-IP)等传统免疫分析法的检测。

本网络研讨会介绍了Duolink PLA技术及其应用,以及它的多种变体。

Duolink:一种用于蛋白质修饰或复合物形成的检测、定量、和细胞定位的多功能工具
主讲人: Sigma-Aldrich的Tom Juehne博士,

蛋白质互作在内源性表达水平上的可视化是生命科学领域的一项重大进步。 使用PLA技术的Duolink使得研究人员能够直接观察细胞信号传导通路,从而有助于对健康和疾病状态的表型反应的研究。Duolink是用于检测、定量和定位细胞质内信号事件的多功能工具。 PLA使得研究人员可以观察和定量蛋白质翻译后修饰,定义复杂的互作,阐释复杂的蛋白簇,或放大低丰度的单一事件的能力。Duolink也被证明可用于实现可视化易位事件。我们将对使用PLA技术的Duolink的多功能性进行讨论和展示,并演示如何将这一强大工具应用于内源性细胞水平的生命科学研究中。

PLA及 Duolink 介绍
邻位连接技术的变体

主讲人:乌普萨拉大学OlaSöderberg博士

蛋白质或信号网络的活性状态可以通过原位邻位连接技术(原位PLA)进行可视化。该技术使用配备有DNA寡核苷酸(邻近探针)的一对抗体靶向发生互作蛋白。这种探针的近端结合,从而形成一个环状DNA分子,其可作为互作的替代标记。我将描述如何使用不同版本的原位PLA来分析蛋白质间的互作、翻译后修饰、以及蛋白质-DNA的互作。我还将介绍一种原位PLA的多路复用版本,其中每个不同的邻近探针中都引入了独特的标签。产生原位PLA信号的组合事件将具有用于每种蛋白质互作的唯一标识标签。通过将原位PLA与闭合探针相结合,可以在固定组织切片中进行表达mRNA的基因分型的同时,实现对信号活性的分析,并且在提供单分子分辨率的同时保留结构信息。这种“新一代病理学”不仅可以分析整个组织切片中的分子谱,还可以用来评估细胞通讯如何影响细胞程序。

将邻位连接技术(PLA)整合到您的研究项目中 - 2015年3月17日

主讲人:Bethyl实验室Joe Roethele

邻位连接技术(PLA)是用于对细胞或组织中的抗体靶标进行原位分析的强大技术。这种基于抗体的应用非常强大,并且能够提供有关蛋白质的定位和/或互作的独特数据。该网络研讨会将采用能够帮助所有研究人员的方法,对PLA的发展情况进行概述 ,无论研究人员是否对此应用具有使用经验。 所涉及的主题将包括以下内容:入门指南,实验设计阶段所涉及的关键生物信息学调研的相关提示,与执行测定相关的实验室工作具体细节以及故障排除建议,以便研究人员完善检测内容并成功将该技术整合至他们的研究计划中。

EGFR信号相关复合物在人类癌症中的分子注释 - 2015年3月26日

主讲人:Moffitt癌症中心Eric B. Haura博士

质谱和一些其他方法,如酵母双杂交,现在已经可以准确地识别在诸如癌症等疾病中的蛋白质复合物或更复杂的蛋白互作,但仍难以将这些技术应用于人类样本中。为了克服这一障碍,我们开始使用邻位连接技术(PLA),直接将蛋白复合物转化为人类肿瘤材料。作为测试案例,我们开发了反映表皮生长因子受体(EGFR)的信号相关蛋白复合物的PLA,并展示了该技术在大量细胞系、小鼠异种移植模型和人类肺癌组织中的实用性。我们的实验表明了EGFR和GRB2蛋白之间能够形成复合物,其中GRB2是EGFR途径激活和与下游MAPK信号转导偶联所必需的关键衔接蛋白。我们注释了近300种癌症原发性异种移植模型(PDX),并展示了富集EGFR:GRB2信号相关复合物的肿瘤亚型。此外,具有丰富EGFR:GRB2信号相关复合物的肿瘤更可能对基于抗EGFR抗体的疗法产生反应。最后,在350个肺癌组织中,通过三个不同的患者组别,我们证明了EGFR:GRB2蛋白复合物鉴别肿瘤的能力,并且在具有高水平的EGFR:GRB2信号相关复合物的患者肿瘤中显示出对EGFR酪氨酸激酶抑制剂疗法的益处。这表明癌症组织中信号相关蛋白复合物的注释不仅可以对疾病类型进行分子注释,还可能具有对癌症治疗剂的预测能力。这里所提到的方法也可以应用于其他疾病类型,从而通过特定疾病相关蛋白复合物的存在来更好地表征疾病。这项工作以更实用的方式开启了人类蛋白质互作组作为一类新的疾病分子标记的应用。由DNA编码的蛋白质不能单独起作用,而是作为推动正常和疾病生理学的多蛋白质复合物的一部分起作用。因此,对这种复合体的注释可能会给疾病表征带来新的视角。重要的是,尽管我们只是展示了这种方法在癌症、受体酪氨酸激酶信号转导和酪氨酸激酶抑制剂治疗中的实用性,但是我们在此描述的方法可以用于广泛的信号相关复合物和不同类型的疾病,因此将受到更多人的关注。

使用原位杂交和邻位连接技术在单一人类癌细胞中在特定基因组基因座(SEPTIN9)上对DNA甲基化(5mC)进行可视化分析 - 2015年4月14日

主讲人:Sigma-Aldrich分子生物技术高级科学家Vikas Palhan博士

虽然有许多技术可以在基因组规模上研究表观遗传标记,如DNA和组蛋白甲基化,但是在该领域中,研究人员需要在单个细胞中的单个基因组位点可视化这些表观遗传标记。这样的应用需要高度灵敏的检测方法。为此,我们开发了一种方案来进行原位杂交,然后进行邻位连接测定(又名Duolink®)和细胞成像,以期在SEPTIN9启动子上可视化DNA甲基化(5meC)。 SEPTIN9启动子甲基化是结肠癌的已知生物标志物。在优化交联、细胞透化和染色质可及性之后,通过与靶向人类SEPTIN9启动子中的CpG岛的生物素化-寡核苷酸探针池杂交来确定基因组特异性。Duolink检测使用抗生物素和抗5meC抗体、相应的邻位连接检测探针、以及远红检测试剂进行测定。

通过荧光显微镜观察显示在转移性前列腺癌DU145细胞(二倍体17号染色体--SEPTIN9基因的位置)和结肠癌SW480细胞(三倍体Chr17)中分别有两个和三个红色斑点。在正常细胞(BJ)或使用非特异性寡核苷酸探针(LacZ)组中未观察到信号。当用已知阻断DNA甲基化的药物5-AzaC处理DU145细胞后,发现Duolink信号减少。为证明这一研究概念,我们会将该实验扩展到冷冻和福尔马林固定石蜡包埋的人类癌症组织样本中。

同时,我们也将根据Duolink检测获取荧光成像数据,从而监测EZH2组蛋白甲基转移酶与前列腺癌(DU145)细胞中H3K27me3表观遗传标记的互作。Duolink信号的降低表明小分子抑制剂SAHA和GSK343能够抑制EZH2的活性。

Duolink在生物医学中的应用:一项解开分子机制和揭示间隙连接中隐藏的超微结构特征的技术 - 2015年4月28日

主讲人:南卡罗来纳医科大学J. Matthew Rhett博士

间隙连接(GJs)是细胞间通道的大聚集体,这些通道能够促进小分子和离子在两个互作细胞之间的扩散。GJ细胞间通道通过两个半通道的互作形成,称为半通道,由寡聚化的连接蛋白的亚基组成。GJ和半通道在组织功能中具有许多重要的生理和病理作用,包括动作电位在心脏中的传播,肿瘤生长和转移,炎症反应和适应性免疫,伤口愈合和中枢神经系统中的电突触传递。最广泛表达的连接蛋白异构体是Cx43,其在上述过程中的调控一直是GJ研究的主要焦点。在过去的二十年中,与Cx43的胞质羧基末端的蛋白-蛋白互作已经成为控制GJ生命周期、通道门控和通道独立功能的内源性机制。我们使用Duolink邻位连接技术(PLA)作为研究培养细胞中与Cx43蛋白互作的技术。该技术的两个独特方面 (亚细胞定位和标记的二元性质)与标准的免疫荧光共焦成像技术相结合,产生了对GJ超微结构、动作电位传导、以及Cx43运输的机械调节和半通道增生至GJ块过程的意想不到的解析。在本次报告中,我将对Duolink PLA的实际应用、合适的对照实验、以及数据分析进行解释。

自噬机制调节细胞死亡转换:邻位连接技术的新见解 - 2017年6月20日

主讲人:丹佛科罗拉多大学Megan Goodall博士

虽然自噬控制着细胞死亡和生存,但人们对其潜在机制了解甚少。 2016年诺贝尔医学奖授予Yoshinori Ohsumi,彰显了这一过程的重要性。然而,自噬是否会影响细胞死亡或控制细胞程序性死亡的其他方面仍不清楚。

MAP3K7是一种肿瘤抑制基因,与前列腺癌的无病存活率相关。该网络报告报道了小鼠前列腺细胞中的Map3k7缺失能够通过TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导细胞死亡。令人惊讶的是,这种死亡主要通过坏死而非凋亡发生。邻位连接技术(PLA)能够显示与自噬机制相关的坏死体的组装,该过程是由p62 / SQSTM1招募RIPK1介导的。此外,如果阻断p62依赖的自噬机制中招募坏死体的过程,则细胞死亡机制会转变为细胞凋亡。这些数据表明,自噬机制可以通过作为支架而不是通过降解货物蛋白来控制程序性细胞死亡的机制,并且在自噬的不同阶段对其进行抑制对于细胞死亡是至关重要的。

在这个网络报告中,你将可以学到:

  • 坏死体与自噬机制相关
  • 抑制自噬促进或抑制细胞死亡,取决于对早期或晚期途径进行抑制
  • 自噬通过p62 / SQSTM1调节细胞死亡模式(凋亡与坏死性凋亡)