Étude de cas de la mise au point d'un essai de qPCR pour soutenir la recherche sur le SARS-CoV-2

Support disponible pour la détection de cibles

Nous travaillons main dans la main avec les autorités de santé publique et des clients pour soutenir la lutte contre le nouveau coronavirus (SARS-CoV-2). Pour répondre aux besoins de la communauté scientifique internationale en matière réactifs spécifiques et de protocoles pour le SARS-CoV-2, nos scientifiques ont mis au point des essais de qPCR pour la détection de la cible SARS-CoV-2 (cf. le Tableau 1 ci-dessous). Veuillez noter que tous les travaux sont in silico ; aucune donnée de laboratoire n'est disponible pour l'instant.

Remarques spécifiques concernant la mise au point de l'essai et la réactivité

SARS-CoV-2 présente une homologie de 95 % avec les virus du SRAS, créant un risque élevé de réactivité croisée. Veuillez garder les remarques suivantes à l'esprit lors de la conception de vos expériences à l'aide du Tableau 1 :

  1. Pour tous les essais, aucune réactivité croisée avec un génome humain ou bactérien/séquences d'ARNm n'a été identifiée dans GenBank.
  2. Les deux essais SYBR Green, essais 1 et 2, ne correspondent de façon identique à aucun autre virus ; toutefois, ils peuvent reconnaître les virus du SRAS avec 2–3 mésappariements de bases.
  3. Les essais avec sonde à double marquage, essais 3–6, peuvent être utilisés en parallèle pour atténuer les problèmes de réactivité croisée.
    1. Les essais 3 et 4 ne correspondent de façon identique à aucun autre virus, mais peuvent reconnaître d'autres virus (surtout du SRAS) avec plusieurs mésappariements de bases. Ces essais peuvent détecter le SARS-CoV-2 de façon fiable, car chacun concerne une région hautement conservée, mais ils peuvent également capturer des faux positifs.
    2. Les essais 5 et 6 ne présentent aucune réactivité avec un autre virus quel qu'il soit, y compris avec le SRAS, ils ne devraient donc ne détecter que le SARS-CoV-2 ; cependant, ces essais concernent une région hautement variable et risquent donc de ne pas capturer tous les variants.
    3. Par conséquent, les essais 3 et 4 peuvent être utilisés pour détecter les résultats positifs, tandis que les essais 5 et 6 peuvent servir à éliminer les faux positifs.

Tableau 1. Essais de détection du SARS-CoV-2 par qPCR
 

Essai Méthode de détection Amorce sens Amorce antisens Sonde Séquence de la sonde
1 SYBR® Green GCCTCTTCTCGT
TCCTCATCAC
AGCAGCATCACCG
CCATTG
   
2 SYBR® Green AGCCTCTTCTCG
TTCCTCATCAC
CCGCCATTGCCAG
CCATTC
   
3 Sonde à double marquage CCGCAAGGTTCT
TCTTCGTAAG
TGCTATGTTTAGT
GTTCCAGTTTTC
A AAGGATCAGTGCC
AAGCTCGTCGCC
4 Sonde à double marquage GGCTTACCGCAA
GGTTCTTC
TGCTATGTTTAGT
GTTCCAGTTTTC
A AAGGATCAGTGCC
AAGCTCGTCGCC
5 Sonde à double marquage CAGGTATATGCG
CTAGTTATCAGAC
CCAAGTGACATAG
TGTAGGCAATG
B AGACTAATTCTCC
TCGGCGGGCACG
6 Sonde à double marquage GCAGGTATATGC
GCTAGTTATCAG
ACACTGGTAGAAT
TTCTGTGGTAAC
B AGACTAATTCTCC
TCGGCGGGCACG

Essai de témoin positif du SRAS par rapport au SARS-CoV-2

Pour mieux différencier les virus du SRAS et le SARS-CoV-2, nous avons conçu l'essai de témoin positif du SRAS (cf. le Tableau 2 ci-dessous). Veuillez garder les remarques suivantes à l'esprit lors de la conception de vos expériences à l'aide du Tableau 2 :

  1. Cet essai concerne une région hautement conservée du génome du SRAS, permettant la détection de multiples variants du SRAS.
  2. Cet essai ne reconnaît aucune séquence humaine, bactérienne ou virale, y compris le SARI (Severe Acute Respiratory Infection).

Tableau 2. Essai de qPCR de témoin positif du SRAS
 

Essai Méthode de détection Amorce sens Amorce antisens Sonde Séquence de la sonde
Témoin positif du SRAS Sonde à double marquage GCTGTGTGTTTGC
CTATGTTGG
ACGTTCACGACTC
AGTATCTCAAG
Témoin du SRAS AGCGTGCCTACTG
GGTTCCTCGTGC

Conception d'amorces et de sondes pour le SARS-CoV-2

Ces conceptions d'amorces et de sondes peuvent être téléchargées en utilisant les formulaires ci-dessous. Modifiez-les pour définir le format que vous souhaitez, puis soumettez-les nous via notre service de commande en ligne d'oligos & de sondes de qPCR à façon. Pour de plus amples informations, veuillez contacter oligotechserv@sial.com.
 

Analyse génétique par RT-PCR et RT-qPCR & réactifs associés

Nous sommes déterminés à fournir aux chercheurs les réactifs et l'expertise technique pour les accompagner dans la lutte contre l'épidémie de SARS-CoV-2. Explorez notre offre de produits pour la RT-PCR et la RT-qPCR et de réactifs associés qui conviennent à la recherche du vaccin contre le SARS-CoV-2.

Kit Transcriptor One-Step RT-PCR

Utilisant la technologie de RT-PCR en une étape avec démarrage à chaud, le kit Transcriptor One-Step RT-PCR inclut un mélange d'enzymes, comprenant une Taq polymérase et une polymérase de correction sur épreuves, pour garantir une transcription inverse sensible et robuste. À l'exception de la matrice et des amorces, le kit Transcriptor One-Step RT-PCR fournit tous les éléments nécessaires pour une RT-PCR en une étape.

KAPA PROBE FAST One-Step (Actuellement non disponible aux États-Unis)

KAPA PROBE FAST One-Step est conçu pour une quantification d'ARN en une étape, à haut débit et cycles thermiques rapides. KAPA PROBE FAST One-Step convient à une utilisation avec toutes les technologies utilisant des sondes fluorogènes, y compris les sondes d'hybridation (par ex. FRET), les sondes d'hydrolyse (par ex. TaqMan®) et les sondes de déplacement (par ex. les balises moléculaires).

Système Titan™ One Tube RT-PCR

Incorporant un mélange de trois enzymes, le système Titan™ One Tube RT-PCR utilise la transcriptase inverse AMV pour la synthèse de l'ADNc de premier brin et le mélange d'enzymes Expand™ High Fidelity, constitué d'une Taq polymérase et d'une polymérase avec activité de correction d'épreuves, pour l'amplification de l'ADNc par PCR.

Kit Quantitative RT-PCR ReadyMix™

En plus de contenir la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney (M-MLV RT) pour la synthèse de l'ADNc de premier brin, le kit Quantitative RT-PCR ReadyMix™ est idéalement mélangé avec l'ADN Taq polymérase JumpStart, des désoxynucléotides purs à 99 %, du tampon et des stabilisateurs, et est vendu sous la forme d'un concentrat (concentré 2x).

Kit KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™

Convenant à toutes les chimies de sondes à double marquage, le kit KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ comprend tous les éléments requis pour une RT-qPCR, à l'exception de la matrice d'ARN et de la sonde. Le kit KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ est disponible avec ou sans marqueur de référence ROX™.

Tableau 3. RT-PCR, RT-qPCR et réactifs associés
 

Description Réf.
Kit Transcriptor One-Step RT-PCR TOSRTRO
KAPA PROBE FAST One-Step KK4752
Système Titan™ One Tube RT-PCR 11855476001
Kit Quantitative RT-PCR ReadyMix™ QR0200
Kit KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ KCQS07
Kit KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™, faible quantité de ROX™ KCQS08
Kit KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™, avec marqueur ROX™ KCQS09
Eau exempte de nucléases, de qualité moléculaire W4502


Nous allons continuer à suivre la situation et à travailler en étroite collaboration avec nos clients pour soutenir les efforts réalisés en réponse à l'urgence de santé publique de portée internationale, décrétée par l'OMS. N'hésitez pas à partager notre jeu d'amorces et de sondes pour la détection du SARS-CoV-2 par qPCR. Contactez-nous pour un support accéléré pour le développement d'un vaccin contre le SARS-CoV-2.