Fallstudie zum Coronavirus-qPCR-Design & Produkte für die SARS-CoV-2-Forschung

Coronavirus-qPCR Primer- und Sonden-Design für SARS-CoV-2

Wir arbeiten Hand in Hand mit öffentlichen Gesundheitsbehörden und Kunden, um den Kampf gegen das neue Coronavirus (SARS-CoV-2) zu unterstützen. Angesichts des globalen Bedarfs nach SARS-CoV-2-spezifischen Reagenzien und Protokollen haben unsere Wissenschaftler qPCR-Assays zur SARS-CoV-2-Targetdetektion entwickelt (siehe Tabelle 1, nachstehend). Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren vorgesehen.

Besondere Hinweise zum Assaydesign & zur Reaktivität

SARS-CoV-2 weist eine 95%ige Homologie zu SARS-Viren auf, wodurch ein hohes Risiko für Kreuzreaktivität besteht. Berücksichtigen Sie bitte die folgenden Hinweise, wenn Sie Tabelle 1 für Ihre Versuchsplanung heranziehen:

  1.  Bei keinem der Assays wurden Kreuzreaktivitäten mit humanen oder bakteriellen Genom/mRNA-Sequenzen in der GenBank identifiziert.
  2. Die beiden SYBR Green-Assays, Assay 1 und 2, sind mit keinem anderen Virus identisch; sie erkennen jedoch ggf. SARS-Viren mit 2–3 fehlgepaarten Basen.
  3. Die doppelt markierten Sonden-Assays, Assay 3–6, können parallel verwendet werden, um Kreuzreaktivitätsprobleme zu mindern.
    1. Assay 3 und 4, sind mit keinem anderen Virus identisch, erkennen jedoch andere Viren (vorwiegend SARS) mit mehreren fehlgepaarten Basen. Diese Assays können die Ziel-Sequenz zuverlässig nachweisen, da jeder in eine hochkonservierte Region fällt, sie können jedoch auch falsch-positive Ergebnisse liefern.
    2. Assays 5 und 6 zeigen keine Reaktivität mit anderen Viren, einschließlich SARS, und sollten daher spezifisch nur die Ziel-Sequenz nachweisen. Diese Assays fallen jedoch in eine stark variable Region, so dass ggf. nicht alle Varianten erkannt werden.
    3. Folglich können die Assays 3 und 4 für den positiven Nachweis eingesetzt werden, während 5 und 6 zur Ausscheidung falsch-positiver Ergebnisse verwendet werden können.

Tabelle 1. qPCR-Assays zur Detektion von SARS-CoV-2
 

Assay Detektionsmethode Vorwärtsprimer Rückwärtsprimer Sonde Sondensequenz
1 SYBR® Green GCCTCTTCTCGT
TCCTCATCAC
AGCAGCATCACCG
CCATTG
   
2 SYBR® Green AGCCTCTTCTCG
TTCCTCATCAC
CCGCCATTGCCAG
CCATTC
   
3 Doppelt markierte Sonde CCGCAAGGTTCT
TCTTCGTAAG
TGCTATGTTTAGT
GTTCCAGTTTTC
A AAGGATCAGTGCC
AAGCTCGTCGCC
4 Doppelt markierte Sonde GGCTTACCGCAA
GGTTCTTC
TGCTATGTTTAGT
GTTCCAGTTTTC
A AAGGATCAGTGCC
AAGCTCGTCGCC
5 Doppelt markierte Sonde CAGGTATATGCG
CTAGTTATCAGAC
CCAAGTGACATAG
TGTAGGCAATG
B AGACTAATTCTCC
TCGGCGGGCACG
6 Doppelt markierte Sonde GCAGGTATATGC
GCTAGTTATCAG
ACACTGGTAGAAT
TTCTGTGGTAAC
B AGACTAATTCTCC
TCGGCGGGCACG

SARS vs. SARS-CoV-2 Positivkontrollassay

Um SARS-Viren und SARS-CoV-2 besser differenzieren zu können, haben wir den folgenden SARS-Positivkontrollassay entwickelt (siehe Tabelle 2, nachstehend). Berücksichtigen Sie bitte die folgenden Hinweise, wenn Sie Tabelle 2 für Ihre Versuchsplanung heranziehen:

  1. Dieser Assay fällt in eine hochkonservierte Region des SARS-Genoms und ermöglicht so die Detektion mehrerer SARS-Varianten.
  2. Dieser Assay erkennt keine humanen, bakteriellen oder anderen viralen Sequenzen, einschließlich SARI.

Tabelle 2. SARS qPCR-Positivkontrollassay
 

Assay Detektionsmethode Vorwärtsprimer Rückwärtsprimer Sonde Sondensequenz
SARS-Positivkontrolle Doppelt markierte Sonde GCTGTGTGTTTGC
CTATGTTGG
ACGTTCACGACTC
AGTATCTCAAG
SARS-Kontrolle AGCGTGCCTACTG
GGTTCCTCGTGC

Bestellung von SARS-CoV-2 Primern und Sonden

Vorgefertigte Primer & Sonden

Unsere o.g. qPCR-Assaydesigns können ab sofort über unsere KiCqStart® Produktlinien bestellt werden.
 

Unsere doppelt markierten KiCqStart-Sonden sind mit unserem eigenen lizenz- und gebührenfreien Onyx Quencher (OQ) markiert. Der OQ ist auch mit kundenspezifischen Sondenbestellungen erhältlich. Um weiterführende Informationen über den OQ zu erhalten, kontaktieren Sie bitte oligotechserv@merckgroup.com.
 

Kundenspezifische Primer & Sonden

Wir verfügen über eine kommerzielle Lizenz zur Bereitstellung von Sonden, die mit dem Black Hole Quencher® (BHQ®) & BlackBerry® Quencher (BBQ®) zum Nachweis von SARS-CoV-2 markiert sind.

Um ein Preisangebot für kundenspezifische Primer und Sonden zu erhalten, e-mailen Sie bitte sirnarequest@milliporesigma.com.
 

Kundenspezifische Positivkontrollen

Das SARS-CoV-2 besitzt ein positives ssRNA-Genom. Wir bieten in vitro transkribierte ssRNA gegen Regionen dieses Genoms an, die als Positivkontrollen eingesetzt werden können. Wir können kundenspezifische Sequenzen von 150 bis zu 420 Nukleotiden synthetisieren (um eine erfolgreiche Herstellung zu gewährleisten, vermeiden Sie bitte Sequenzen mit invertierten Wiederholungen und Repetitionen). Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren vorgesehen.

Um ein Preisangebot oder weitere Informationen zu erhalten, e-mailen Sie bitte sirnarequest@milliporesigma.com.

RT-PCR und RT-qPCR Genanalyse- und Hilfsreagenzien

Unser Ziel ist es, Wissenschaftlern die Reagenzien und Fachkompetenz für eine rasche Bekämpfung von SARS-CoV-2 bereitzustellen. Entdecken Sie unser Angebot an erstklassigen RT-PCR-, RT-qPCR- und Hilfsreagenzien, die für die SARS-CoV-2-Impfstoffforschung geeignet sind.

Transcriptor One-Step RT-PCR Kit

Das Transcriptor One-Step RT-PCR Kit nutzt die einstufige RT-PCR-„Heißstart“-Technologie und beinhaltet ein Enzymgemisch, einschließlich einer Taq-DNA-Polymerase und Proofreading-Polymerase, um eine empfindliche und robuste reverse Transkription zu gewährleisten. Außer Templates und Primern enthält das Transcriptor One-Step RT-PCR Kit alle Komponenten, die für die einstufige RT-PCR benötigt werden.

KAPA PROBE FAST One-Step (in den USA gegenwärtig nicht erhältlich)

KAPA PROBE FAST One-Step ist für die einstufige Hochdurchsatz-RNA-Quantifizierung im Schnellzyklusverfahren konzipiert. KAPA PROBE FAST One-Step ist zur Verwendung mit allen auf fluorogenen Sonden basierten Technologien geeignet, einschließlich Hybridisierungssonden (z.B FRET), Hydrolysesonden (z.B. TaqMan®) und Verdrängungssonden (z.B. Molecular Beacons).

Titan™ One Tube RT-PCR System

Das Titan™ One Tube RT-PCR System enthält ein Gemisch aus drei Enzymen und nutzt AMV reverse Transkriptase für die Erststrang-cDNA-Synthese sowie das Expand™ High-Fidelity-Enzymgemisch, das aus einer Taq DNA-Polymerase und einer Proofreading-Polymerase besteht, zur cDNA-Amplifikation mittels PCR.

Quantitative RT-PCR ReadyMix™

Der Quantitative RT-PCR ReadyMix™ enthält Moloney-Maus-Leukämie-Virus reverse Transkriptase (M-MLV RT) für die Erststrang-cDNA-Synthese sowie JumpStart Taq DNA-Polymerase, 99 % reine Deoxynukleotide, Puffer und Stabilisatoren und wird als 2x-Konzentrat geliefert.

KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™

Der KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ enthält alle für die RT-qPCR benötigten Komponenten außer RNA-Template und Sonde. KiCqStart® One-Step Probe RT-qPCR ReadyMix™ ist mit oder ohne ROX™ Referenzfarbstoff erhältlich.

SYBR® Green Quantitative RT-qPCR

Dieses Kit enthält eine fertige Mischung aus Moloney-Maus-Leukämie-Virus reverser Transkriptase (M-MLV RT) und JumpStart Taq-Polymerase und bietet somit eine hochempfindliche Methode für die quantitative Genexpressionsanalyse.

RNA-Interferenz

Unser MISSION® esiRNA COVID-19-Panel (51 Gene mit 2 Kontrollen) bietet RNAi-Forschern eine bewährte, kosteneffektive und einfache Methode für die posttranskriptionale Stummschaltung von Genen, die vermutlich am intrazellulären Lebenszyklus des SARS-CoV-2 beteiligt sind. Das Panel beinhaltet Gene, die an der durch andere Coronaviren wie SARS-CoV und MERS verursachten Infektion beteiligt sind. Das Panel ist als individualisierbarer esiFLEX 96-Well-Array mit bis zu 5,0 µg erhältlich, was für das Screening gebräuchlicher humaner Zelllinien ausreichend ist. Nur für Forschungszwecke.  Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren vorgesehen.
 

Im Lieferumfang der Panels ist Folgendes enthalten:

  • Positivkontrolle: Humanes Eg5 (KIF11) für optimale Transfektion & Versuchsdurchführung
  • Negativkontrolle: RLUC zur Unterscheidung sequenzspezifischer Stummschaltung von unspezifischen Effekten

Um ein Preisangebot oder weitere Informationen zu erhalten, e-mailen Sie bitte sirnarequest@milliporesigma.com.

Wir werden die Situation weiter beobachten und eng mit unseren Kunden zusammenarbeiten, um die Reaktionsbemühungen auf diese globale WHO-Notlage zu unterstützen. Bitte teilen Sie unsere Primer- und Sonden-Sets zur qPCR-Detektion von SARS-CoV-2 und Biochemikalien für die Impfstoff- und Diagnostikaforschung mit Ihren Kollegen (PDF-Download).

Kontaktieren Sie uns für umgehende Unterstützung bei der SARS-CoV-2-Impfstoffentwicklung.