有機合成化学

蛍光レチノイドプローブ

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細胞イメージング、タンパク質リガンド結合アッセイ、フローサイトメトリーで使用可能な蛍光レチノイン酸誘導体

蛍光レチノイドプローブとは?

LightOx蛍光レチノイドプローブ(図1)は、UV/近紫外光で励起されると強い蛍光ソルバトクロミズムを示す、オールトランスレチノイン酸(ATRA)の合成誘導体です1。生物学的アッセイにおいて、LightOx蛍光レチノイドプローブは、ATRAと同等またはより強い生物活性を持つため、特にレチノイン酸受容体(RAR)を含む幅広いアッセイでATRAの代替品として使用可能です2-5。LightOx17(図2)は、他の誘導体より長い分子構造を有しておりレチノイド活性を示さず、他のレチノイド誘導体と同様の特性を持つ非生物活性蛍光プローブとして提供されています。

LightOx


図1 LightOx蛍光レチノイドプローブの構造



LightOx-17


図2 非生物活性なLightOx蛍光レチノイドプローブ






LightOxの蛍光特性

LightOx蛍光レチノイドプローブは、一般的なUV-A(DAPIフィルターセットなど)および紫色光源(405 nm)で励起可能です。LightOxの蛍光は、細胞内であれば蛍光顕微鏡、キュベットベースの蛍光測定であれば分光光度計、および一般的なプレートリーダーでも簡単に検出可能です。

励起および蛍光は、ソルバトクロミズム特性を示します(図3-4)。特に、蛍光波長と強度は周辺環境に大きく依存します(図4)。非極性環境では高強度かつ青方偏移し、極性環境では強度が下がり赤方偏移します。この特性から、例えば蛍光顕微鏡での観察からは、局在だけでなく、局在場所の情報を確認することができます。

LightOx Absorption

図3 様々な溶媒中におけるLightOx14の吸収スペクトル


LightOx Emission

図4 様々な溶媒中におけるLightOx14の蛍光スペクトル

 


 

レチノイド結合タンパク質への結合特性

LightOx蛍光レチノイドプローブの大部分は、レチノイン酸受容体(RAR)および細胞レチノイン酸結合タンパク質II(CRABPII)(表1)を含むレチノイド結合タンパク質に対して高い結合親和性を示します(非RAR結合コントロールのLightOx17を除く)。この強い結合は、競合的蛍光結合アッセイの開発に利用できます。タンパク質ターゲットからの蛍光レチノイドの変位は、蛍光発光を介してモニタリング可能で、競合リガンドの相対結合親和性を決定するために使用できます。

 

Fluorescent retinoid probe CRABPII Kd/nM
LightOx14 49.1 ± 2.6
LightOx17 ≥875.0 ± 118.4
LightOx19 34.0 ± 2.5
LightOx21 124.8 ± 4.3
LightOx22 94.0 ± 3.7
LightOx23 385.4 ± 28.5
LightOx25 88.3 ± 2.1
LightOx26 51.6 ± 3.2

表1 細胞レチノイン酸結合タンパク質II(CRABPII)に対する蛍光レチノイドの蛍光滴定により決定されるKd(解離定数)

 

LightOx Left Image
LightOx Right Image
図5 HaCaT表皮ケラチノサイトのLightOx14生細胞標識。イメージングの前に細胞に60分間ラベリング。左:増殖性細胞の小さな塊で検出されたLightOx14による核標識。右:部分的に分化した細胞の細胞質および核区画で検出されたLightOx14。
 

 

使用方法
LightOx蛍光レチノイドプローブはDMSOに溶けやすく、最大10mM程度までの濃度にて保存可能です。

 

保管条件および安定性
LightOx蛍光レチノイドプローブは光安定性が高く、使用の際に特別な前処理は不要です。DMSO溶液は暗所・4-20℃環境下で6-12カ月保存可能です。

 

安全な廃棄方法
サンプルは、廃棄する前に漂白剤処理する必要があります。

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参考文献

  1. D. R. Chisholm, C. W. E. Tomlinson, G.-L. Zhou, C. Holden, V. Affleck, R. Lamb, K. Newling, P. Ashton, R. Valentine, C. Redfern, J. Erostyák, G. Makkai, C. A. Ambler, A. Whiting and E. Pohl, ACS Chem. Biol., 2019, 14, 369–377.
  2. C. W. E. Tomlinson, D. R. Chisholm, R. Valentine, A. Whiting and E. Pohl, ACS. Med. Chem. Lett., 2018, 9, 1297–1300.
  3. T. Khatib, A. Whiting, D. R. Chisholm, C. Redfern, B. Müller and P. Mccaffery, Mol. Neurobiol.,
    DOI:https://doi.org/10.1007/s12035-019-1571-9.
  4. T. Khatib, P. Marini, S. Nunna, D. R. Chisholm, A. Whiting, C. Redfern, I. R. Greig and P. Mccaffery, Cell Commun. Signal., 2019, 17, 1–16.
  5. R. Zolfaghari, F. J. Mattie, C. H. Wei, D. R. Chisholm, A. Whiting and A. C. Ross, Anal. Biochem., 2019, 577, 98–109.

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