ADME/Tox & DMPK in vitro systems

ヒト肝細胞株 HepaRG 5Fコントロール細胞株
および各種ノックアウト細胞株

薬物代謝、トランスポーターおよび毒性研究のための高活性ヒト肝細胞株

HepaRG細胞は、他の肝癌由来細胞株と比較して、主に強化された薬物代謝活性により、ヒト肝アッセイの様々な用途に過去数10年以上ますます使用されています。 初代ヒト肝細胞と比較して、HepaRG細胞はより便利な供給、ロットの画一性、および初代ヒト肝細胞と同等の薬物代謝、トランスポーター活性および毒性特性を提供します。

シグマ アルドリッチ独自の開発:HepaRG 5Fクローンにおける薬物代謝およびCYP450誘導

シグマ アルドリッチは独自のジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)技術を用いていくつかの薬物代謝およびトランスポーターノックアウト細胞株の開発過程で 、増殖能を改善され、機能を向上させたHepaRG細胞株 5Fコントロール細胞株を開発しました。

シグマ アルドリッチのHepaRG 5Fコントロールは、下記の薬物代謝酵素、第2相酵素、核内受容体を発現しています。

シトクロムP450酵素:CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8/9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4
第2相酵素:UGT、SULT、NAT、GST
核内受容体:AhR、PXR、CAR、LXR、FXR

5Fコントロール細胞株の特長

  • 増殖期の細胞収率は野生型HepaRG細胞の2倍以上です。
  • 5Fは、passage 35で基底P450活性を保持しています。
  • 薬物トランスポーター(OCT1、NTCP、OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1、MDR1、MRP2、MRP3およびBSEP)の発現が確認されています。
  • 機能性肝アッセイにて化合物スクリーニングに利用可能です。

Figure 1.
分化した野生型(A)および5F(B)HepaRG細胞形態(×10)

5Fコントロール細胞株は野生型HepaRG細胞と同様、分化誘導によって、成熟型肝細胞および胆管様細胞を形成した。

培養容器 全細胞数 (cells)
野生型 5Fコントロール
凍結バイアル 1.50 × 106 1.50 × 106
T75フラスコ 5.00 × 106 7.30 × 106
T150フラスコ 2個 2.60 × 107 4.04 × 107
ハイパーフラスコ 2個 2.89 × 108 4.00 × 108
ハイパーフラスコ 14個 1.55 × 109 2.80 × 109

Table 1.
細胞増殖期のHepaRG野生型および5Fコントロールの細胞収率

同じ培養条件下での野生型HepaRGと比較して細胞収量がより多くなった。

薬物代謝

シグマ アルドリッチのHepaRG 5Fクローンは、繰り返された継代(Figure 2)および典型誘導剤(例:Figure 2のリファンピシン、CITCO、およびオメプラゾール)による強力なCYP誘導に対して、強固な基底CYP活性を維持します。
さらに、HepaRG 5FクローンをPXR、CARおよびAhR ノックアウト細胞とともに、試験化合物によって活性化されたCYP誘導経路の詳細な調査に使用することも可能です(Figure 3)。

Figure 2.
HepaRG野生型および5Fの複数継代におけるCYP基底活性

HepaRG 5Fクローン細胞株は、繰り返された継代に対しても最適なCYP活性を維持している。

Figure 3.
リファンピン(CYP3A4誘導剤)、CITCO(CYP2B6誘導剤)、またはオメプラゾール(CYP1A2誘導剤)で処理したHepaRG 5Fにおける強力なCYP誘導

HepaRG PXR ノックアウト細胞株、CAR ノックアウト細胞株およびAhR ノックアウト細胞株は、CYP誘導の完全な喪失を示した。

薬物トランスポーター

分化したHepaRG細胞における類洞および細管の薬物トランスポーターの発現および機能的活性が測定され、初代ヒト肝細胞に見られるものに近いことが実証されています。 測定されたトランスポーターは、 OCT1、NTCP、OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1、MDR1、MRP2、MRP3およびBSEPです。
5Fクローンは、一般的な基質の能動的な取り込みと流出輸送を実証しています。 例えば、5Fクローンは、タウロコール酸(TCA)の強力な取り込み輸送動態を示し、19.68 μMのKm値および119.9 pmol/min/mgのVmax値を示します(Figure 4)。

Figure 4.
HepaRG 5Fにおけるタウロコール酸(TCA)の輸送動態

肝毒性

HepaRG細胞は、これまでに報告された最も代謝活性の高い肝細胞株であり、CYP誘導、代謝、クリアランス、および一般的な毒性試験を含む多くの機能性肝アッセイにおいて、実行可能な代替品として使用する可能性があります。
HepaRG 5Fクローンは、様々な肝毒性アッセイ(例:細胞毒性、ミトコンドリア毒性、脂肪症、胆汁うっ滞)における化合物スクリーニングに利用することが可能です。

Figure 5.
クロルプロマジンおよびアモジアキンで処理(48 hr)したHepaRG 5FのMTTアッセイによる生存率

製品名 包装 カタログ番号
HepaRG™ 5F Clone control Cells 1 x 107 cells/vial MTOX1010-1VL

仕様

  • マイコプラズマ陰性
  • 肝細胞癌がんおよびC型肝炎ウィルスに罹患している女性患者の肝腫瘍由来
  • 偽二倍体の核型を持ち、DMSO存在下で胆管系および肝細胞系の両方に分化する能力を有する

継代培養をしてご使用になる場合は、Millipore Sigma社とライセンス契約を締結いただく必要があります。詳細はお問い合わせください。

HepaRG™ 各種ノックアウト細胞株

特長

  • トランスポーターおよび核内受容体遺伝子を完全に機能的ノックアウト
  • 第1相および第2相代謝、トランスポーター活性を含む、関連するin vivo機能性評価に使用可能

CAR, PXR & AhR ノックアウト細胞株

対象核内受容体: CAR、PXR 、AhR
核内受容体であるCAR、PXR 、AhRの活性化ならびに薬物によるCYP1A2、CYP2B6、CYP3A4に対する誘導は、薬物相互作用に起因する副作用を引き起こす可能性があり、代謝試験の確認項目として挙げられています。

Figure 6.
PXRノックアウト(A)、CAR ノックアウト(B)、およびAhR ノックアウト(C)の細胞形態(×10)

HepaRG 5F細胞株と比較して、CAR、PXR、AhRノックアウト細胞株の基底CYP450活性および誘導について評価しました。 CARノックアウト細胞株は、5Fコントロール細胞株と比較してCYP1A2、2C9、2D6、3A4は同様の基底活性を示しました。しかし、CYP2B6の基底活性は5Fコントロール細胞株より低下しています。同様に、PXRノックアウト細胞株は5Fコントロール細胞株と比較してCYP1A2、2C9、2D6、2B6は同様の基底活性を示しましたが、CYP3A4の基底活性は低下しています(Figure 11)。

CARノックアウト細胞におけるCYP2B6誘導検証では、CAR特異的CYP2B6誘導剤CITCOで処理後、有意な誘導を示しませんでしたが、複数経路を介してCYP2B6を誘導する誘導剤フェノバルビタールで処理した場合は、CYP2B6誘導を示しました(Figure 7)。 また、PXR特異的3A4誘導剤リファンピンで処理した場合、PXRノックアウト細胞はCYP3A4誘導を示しませんでしたが、5Fコントロール細胞株ではCYP3A4誘導を示しました(Figure 8)。

Figure 7.
5Fコントロール細胞株およびCARノックアウト細胞におけるCYP2B6の誘導

HepaRG CARノックアウト細胞は CITCOで処理後、CYP2B6誘導の完全な消失を示した。ただし、フェノバルビタール(PB)処理後はCYP2B6誘導を示した。

Figure 8.
5Fコントロール細胞株およびPXRノックアウト細胞におけるCYP3A4の誘導

HepaRG PXRノックアウト細胞はリファンピシン(RIF)処理後、CYP3A4誘導の完全な喪失を示した。

AhRノックアウト細胞におけるCYP1A2誘導研究は、HepaRG野生型細胞株を用いました。 CYP1A2誘導に用いた薬剤は、50 mM ランソプラゾール(Lanso)、2 mM 3-メチルコランスレン(3MC)、および40 mM b-ナフトフラボン(BNF)です。 野生型細胞株のCYP1A2誘導は、Lanso、3MC、BNFで処理した後に生じました。また、Lanso、3MC、BNF処理後、野生型細胞株ではCYP1A2誘導の優位差は起こりませんでした(Figure 9)。

Figure 9.
コントロールおよびAhRノックアウト細胞株におけるCYP1A2の誘導

既知の誘導剤を用いたCYP1A2誘導は、野生型細胞株(5Fコントロールではない)と比較して、AhRノックアウト細胞株の誘導を示さない。

CAR、PXR、AhRノックアウト細胞株におけるCYP誘導実験手順

  1. 分化した細胞を24ウェルプレートに細胞密度:4×105細胞/ウェルで播種し4日間培養
  2. 誘導実験に先立って、細胞を前誘導培地中で週末に培養した後、
    • 50 μM オメプラゾール(CYP1A2)
    • 0.5 μM CITCO(CYP2B6)
    • 50 μM リファンピン(CYP3A4)
    • 1 mM フェノバルビタール(CYP2B6 / 3A4)
    上記いずれかの誘導剤含有の無血清誘導培地中で3日間培養
  3. HBSSで洗浄後、Williams’E培地で
    • 200 μM フェナセチン(CYP1A2)
    • 100 μMブプロピオン(CYP2B6)
    • 50 μMテストステロン(CYP3A4)
    上記いずれかの基質と共に2時間培養
  4. LC-MS / MS分析のために、培地を回収しアセトニトリルに置換
  5. 細胞をHBSSで洗浄し、200 μL RIPAバッファーを添加して細胞タンパク質を単離
  6. 遠心分離後、タンパク質濃度をBCAアッセイを用いて測定

Figure 10.
HepaRG 5F細胞株におけるCYP1A2、CYP2B6、およびCYP3A4誘導確認

Figure 11.
5F細胞株および核内受容体ノックアウト細胞株における薬物代謝および第2相酵素

5F細胞株および核内受容体ノックアウト細胞株を用いたP450データは、CARノックアウト細胞株においてCYP2B6活性の有意な低下を示した。一方、AhRノックアウト細胞株のCYP1A2活性、PXRノックアウト細胞株のCYP3A4活性はコントロール細胞株と同等であった。 第2相酵素は、核内受容体変異によって酵素活性に影響を及ぼされないことを確認した。

製品名 包装 カタログ番号
PXR Knockout HepaRG™ Cells 1 x 107 cells/vial MTOX1011-1VL
CAR Knockout HepaRG™ Cells 1 x 107 cells/vial MTOX1012-1VL
AhR Knockout HepaRG™ Cells 1 x 107 cells/vial MTOX1013-1VL

継代培養をしてご使用になる場合は、Millipore Sigma社とライセンス契約を締結いただく必要があります。詳細はお問い合わせください。

排出および取り込みトランスポーターノックアウト細胞株

対象トランスポーター:MDR1(P-gp)、BSEP、MRP3、MRP2、BCRP、MDR3、OATP1B1、OATP1B3
肝トランスポーター試験では、従来、取り込みアッセイには浮遊培養または接着培養した肝細胞が用いられ、排出アッセイにはサンドイッチ培養した肝細胞が用いられてきました。加えて、個々のトランスポーターの特性に関する試験では、トランスポーターを不死化細胞株または膜ベシクルに過剰発現させていました。しかし、基質特異性が重複していること、および現在利用できる阻害剤の特異性の限界により、薬剤排出における肝トランスポーターの役割を完全に理解することは困難です。このような限界にご対応いただくため、シグマ アルドリッチではトランスポーターノックアウト細胞株を作製しました。

薬物性肝障害モデル MDR1 / P-gp ノックアウト細胞株

P-glycoprotein (P-gp) ノックアウト細胞株でもあるHepaRG Multidrug Resistance Protein 1 (MDR1)ノックアウト細胞株は、 P-gpに関連する薬物性肝障害に加え、 P-gpとの薬物相互作用の詳細な研究を可能にします。

P-gpタンパク質発現の消失は、免疫化学染色によって確認されています(Figure 12)。加えて、MDR1ノックアウト細胞株は、 カルセインおよびジゴキシンといった既知の基質の細胞内蓄積において予想通りの変化を示しました(Figure 13)。

Figure 12.
コントロール細胞に対してMDR1ノックアウト細胞のMDR1発現喪失を確認した免疫化学染色

MDR1ノックアウト細胞ではMDR1発現は観察されなかった。
(Hoechst: 核染色)

Figure 13.
コントロール細胞に対するMDR1ノックアウト細胞におけるMDR1基質の蓄積

ノックアウト細胞におけるMDR1機能喪失と一致して、コントロール細胞と比較して、MDR1ノックアウト細胞でカルセイン (左)またはジゴキシン (右)のより高い細胞内蓄積が観察された。また、 MDR1阻害剤存在下でコントロール細胞においても、亢進された蓄積が観察された。

胆汁酸排泄モデル BSEP ノックアウト細胞株

Bile Salt Efflux Protein(BSEP)をノックアウトしたHepaRG細胞株は、胆汁酸合成、輸送および蓄積、薬物相互作用、BSEP基質評価、CYP誘導/阻害、および代謝媒介薬物性肝障害を含む、BSEPに関連する薬物性肝障害(DILI)の詳細な調査を可能にします。

Figure 14.
BSEPノックアウト細胞株におけるBSEP発現の消失

BSEPノックアウト細胞株におけるBSEP発現の消失を確認した免疫化学的染色。 BSEP ノックアウトおよび5F細胞株の両方において、胆管形成(矢印)が確認できる。

BSEPノックアウト細胞株は、胆汁酸合成の減少、個々の胆汁酸排泄の変化、およびトランスポーター発現の変化を含む細胞内胆汁酸濃度の測定可能な変化をもたらしました。これは、5Fコントロール細胞に対するBSEPノックアウト細胞のタウロコール酸の取込減少に反映されました(Figure 16)。BSEPノックアウト細胞は、既知の胆汁うっ滞薬(例: ボセンタンおよびトリグリタゾン)存在下で胆汁酸排泄の変化に5F細胞株より鋭敏に応答し、これら細胞株が胆汁うっ滞細胞傷害メカニズムの研究に有用であることを示唆しています(Figure 17) 。さらに、BSEPノックアウト細胞は、胆汁うっ滞を誘導する既知の薬剤の細胞毒性を増進しました(Figure 15)。

Figure 15.
BSEPノックアウトおよび5F細胞株におけるシクロスポリンAおよびクロルプロマジンの細胞毒性

細胞毒性は試験化合物処理72時間後にATP枯渇によって評価した。シクロスポリンAおよびクロルプロマジンは胆汁うっ滞を誘導することが知られている。

Figure 16.
BSEPノックアウトおよび5Fコントロール細胞におけるタウロコール酸(TCA)の取り込み

BSEPノックアウト細胞における取り込み速度の低下は、NTCPおよびOATP1B1のより低いタンパク質発現を反映している。

Figure 17.
BSEPノックアウトおよびコントロール細胞における胆汁酸(TDCAおよびGCDCA)の細胞内蓄積に対する胆汁うっ滞(Bosentan 、troglitazone)および非胆汁性薬剤( Dipyridamole )の効果

TDCAおよびGCDCAのレベルは、コントロール細胞に対してBSEPノックアウト細胞で胆汁うっ滞性化合物との併用によって24時間で有意に高められた。
データ提供:Yurong Lai, Gilead.

参考文献

Qiu X., et al. Disruption of BSEP Function in HepaRG Cells Alters Bile Acid Disposition and Is a Susceptive Factor to Drug-Induced Cholestatic Injury. (2016) Mol Pharm. 13(4):1206-16. PMID: 26910619

薬物性肝障害モデル MRP2 ノックアウト細胞株

HepaRG Multidrug Resistance-Associated Protein 2(MRP2)ノックアウト細胞株は、MRP2に関連する薬物性肝障害に加え、MRP2との薬物化合物相互作用の詳細な研究を可能にします。
ノックアウト株におけるMRP2タンパク質発現の消失は、ウエスタンブロット(Figure 18)および免疫化学染色(Figure 19)にて確認されています。MRP2ノックアウトおよびコントロール細胞は、HepaRG細胞内で蛍光型の5(6)-カルボキシ-2’, 7’-ジクロロフルオレセイン(CDCF)に代謝される5(6)-カルボキシ-2’, 7’-ジクロロフルオレセインジアセテート(CDCFDA)で処理されました。 MRP2の基質CDCFは、MRP2ノックアウト細胞株の胆管に蓄積しませんでした(Figure 20)。最後に、基質CDCFを用いて、決定された胆汁排泄指数(BEI)からは、MRP2ノックアウト細胞株は胆汁排泄能が低下していることが示されました(Figure 21)。

Figure 18.
分化したHepaRG 5F、MDR1ノックアウトおよびMRP2ノックアウト細胞株のウェスタンブロット

各ノックアウト細胞において、それぞれMDR1タンパク質およびMRP2タンパク質の消失を示した。

Figure 19.
MRP2ノックアウトと5F細胞における毛細胆管からのMRP2発現消失を確認した免疫化学的染色

MRP2ノックアウト細胞ではMRP2発現は観察されなかった。 毛細胆管(矢印)は、MRP2ノックアウトおよびコントロール細胞の両方で明瞭に確認できる。
(IN Cell Analyzer 2200による取得データ、GE社)

Figure 20.
標準Ca2+ HBSS緩衝液中で3 μM CDCFDAで3回処理したHepaRG 5F細胞株およびMRP2ノックアウト細胞の拡大画像

5F細胞の毛細胆管(矢印)にCDCF蛍光(緑色)の有意な蓄積を示す一方で、MRP2ノックアウト細胞の毛細胆管(矢印)は暗いままで蓄積していない。

Figure 21.
標準HBSS (Ca2+ 含有もしくはCa2+不含)バッファーで30分間前処理後、30分間標準Ca2+ HBSSに溶解した3 μM CDCFDAの取り込みを測定した。エラーバーは、n = 3でのCDCFのBEI標準偏差を示す。

製品名 包装 カタログ番号
MDR1 Knockout HepaRG™ Cells 1 x 107 cells/vial MTOX1019-1VL
BSEP Knockout HepaRG™ Cells 1 x 107 cells/vial MTOX1018-1VL
OATP1B3 Knockout HepaRG™ Cells 1 x 107 cells/vial MTOX1016-1VL
MRP2 Knockout HepaRG™ Cells 1 x 107 cells/vial MTOX1020-1VL
MRP3 Knockout HepaRG™ Cells 1 x 107 cells/vial MTOX1105-1VL
MDR3 Knockout HepaRG™ Cells 1 x 107 cells/vial MTOX1029-1VL
BCRP Knockout HepaRG™ Cells 1 x 107 cells/vial MTOX1021-1VL
PERK Knockout HepaRG™ Cells 1 x 107 cells/vial MTOX1024-1VL

継代培養をしてご使用になる場合は、Millipore Sigma社とライセンス契約を締結いただく必要があります。詳細はお問い合わせください。