抗体101 (抗体基礎知識)

二次抗体の選び方

二次抗体とは

抗体そのものに標識などされていない場合、目的のタンパク質に結合した抗体はそのまま検出や可視化することができません。そこで、抗体を認識する抗体つまりイムノグロブリンに対する抗体に標識をして、最初の抗体を検出する方法が非常によく利用されています。目的のタンパク質に対する抗体は一次抗体、一次抗体に対する抗体 (抗イムノグロブリン抗体) は二次抗体と呼ばれます。
二次抗体の標識 (ラベル) として発色用の酵素や蛍光色素、ビオチンなどがあり、アフィニティ精製用にアガロースなどの担体を結合させた抗体も利用されています。
一般的に発色系の場合はアルカリホスファターゼ (AP) やホースラディッシュペルオキシダーゼ (HRP) といった酵素が用いられ、検出用の試薬を与えると標識された酵素と反応して発色が起こります。ビオチン標識はストレプトアビジンを介して AP や HRP による発色の増幅に利用されています。また蛍光色素として FITC、ローダミン、TRITC、Cy3や R-フィコエリスリン (R-PE) などが一般的ですが、そのほかに様々な波長の蛍光色素が利用されています。
二次抗体は一次抗体が何の動物種で作られているか、あるいは一次抗体がモノクローナル抗体の場合はイムノグロブリンのクラスは何かによって選び、検出する方法によって二次抗体の標識を選択します。
さらにバックグラウンドを抑えるために吸収処理済みの二次抗体(pre-adsorbed antibody)やフラグメント化された二次抗体を使用することもあります。

二次抗体を選ぶ基本ポイント

  • 一次抗体の宿主動物 (免疫動物)
    モノクローナル抗体の場合はイムノグロブリンのクラスも確認します。
  • 二次抗体の標識の種類
    検出する方法に応じて標識を選びます。
  • アプリケーション
    二次抗体の製品情報に書かれている使用可能なアプリケーションを参考にして、目的の用途に応じて選びます。

二次抗体の選び方

最適な二次抗体を選ぶヒント

  1. 一次抗体は何の動物種で作られているか?
    二次抗体は一次抗体に対して結合するものなので、一次抗体の免疫動物 (ホスト) によって二次抗体を選ぶ必要があります。もしマウスで作成された一次抗体を使用している場合は、マウスのイムノグロブリンに対する抗体が二次抗体となります。
  2. 一次抗体のクラス・サブクラスは何か?
    一次抗体がモノクローナル抗体の場合に重要なポイントになります。一次抗体がポリクローナル抗体の場合、抗体のイムノグロブリンのクラスは一般的に IgG のため、二次抗体は IgG に対する抗体でおおむね問題ありません。一次抗体がモノクローナル抗体の場合、抗体のイムノグロブリンが IgG ではないこともあります。そのためモノクローナル抗体がどのイムノグロブリンであるか確認し、そのイムノグロブリンクラスに対する抗体を二次抗体として使用する必要があります。例えばモノクローナル抗体のイムノグロブリンがマウス IgM の場合、マウス IgM に対する抗体を用います。またマウスのモノクローナル抗体でイムノグロブリンのサブクラスが不明な場合、多くのマウスイムノグロブリンサブクラスを認識するマウス IgG F(ab) に対する抗体を二次抗体として用いることもできます。
    ヒトやマウスの IgG は多くのクラスやサブクラスがあり二次抗体の選択は複雑になります。ただし IgG, IgM, IgA, IgDおよび IgE はいずれも κ または λ 軽鎖を持ち、つまりこれらの IgG は軽鎖 (κ, λ) が共通しています。一方、重鎖はクラスによって特異的に異なります。
    二次抗体の製品名に書かれている情報と反応性は次のようになります。
    Anti-Fc specific, heavy-chain specific: 重鎖にのみ反応、つまりクラス特異的
    Anti-Fab specific, whole molecule specific: 重鎖と軽鎖に反応。軽鎖の反応性によってすべてのクラスに反応性を示す
    Light chain (kappa, lambda) specific: すべてのクラスに反応
  3. アフィニティ精製された二次抗体や IgG フラクション (イムノグロブリン精製) の二次抗体のどちらが良いか?
    アフィニティ精製された抗体と IgG フラクション抗体のどちらにも利点があり、目的に応じて使い分けられています。非特異的な反応を少なくしたい場合はアフィニティ精製が好まれ、一方少量の抗原を検出する場合は IgG フラクションの方が優れていることがあります。
  4. どの標識を選べば良いか?
    標識は行うアプリケーションによって選ぶ必要があります。イムノブロット、ウェスタンブロットや ELISA で用いられるペルオキシダーゼはアルカリホスファターゼより経済的、安定的な酵素で、化学発光法にもよく用いられています。アルカリホスファターゼは発色法のときペルオキシダーゼより感度が良いという特徴があります。
    細胞や組織の染色ではアルカリホスファターゼやペルオキシダーゼ、あるいは蛍光色素の標識が用いられます。一般的な蛍光色素として FITC, フィコエリスリン, CF™, Atto™, Quantum Red™があります。これらはフローサイトメトリーでも使用されています。
    またビオチン/アビジンによる 2 ステップのシステムは検出の増幅に用いられることがあります。ビオチンはアビジンに非可逆的に強く結合します。この性質を利用して、まずビオチン標識した二次抗体を用い、次にアビジン (またはExtrAvidin™、ストレプトアビジン) が結合した酵素または蛍光色素を与えます。ビオチン標識した二次抗体に複数結合することによってシグナルが増幅されて感度が高くなります。
  5. 吸収処理済みの二次抗体は必要か?
    吸収処理済みの抗体 (pre-adsorbed antibody) とは固定した血清タンパク質や IgG で処理した抗体で、細胞や組織で非特異的なバックグランドを抑えることが期待できます。
  6. F(ab)やF(abʻ)2フラグメント抗体は必要か?
    Fc 受容体を持つ組織や細胞で行う場合、非特異的な結合を抑えるため F(ab) や F(abʻ)2 フラグメントにした抗体が使われることがあります。サンプルとしてリンパ節、脾臓、末梢血から得たものは Fc 受容体 (マクロファージ、 B リンパ球、ナチュラルキラー細胞) を持ち、抗体の Fc 領域に結合することで高いバックグランドが生じます。

二次抗体の製品名の見方

二次抗体製品一覧

ターゲット 免疫動物 吸収処理 非標識 AP Biotin FITC HRP PE その他標識 備考
ウサギIgG
(whole molecule)
ヤギ   R2004 A3687 B7389 F0382 A6154 P9537 金コロイド
G7402
 
ヤギ ヒトIgG R4880 A9919 B8895 F9887 A0545   TRITC
T6778
 
ヤギ
F(ab')2
  R9130 A3937   F1262 A6667 P8172    
マウスIgG
(whole molecule)
ヤギ   M8642 A3562 B7264 F0257 A4416 P9287 金コロイド
G7652
 
ウサギ   M7023 A2418 B8520 F9137 A9044      
ヤギ ヒト血清 M8645 A3688 B6649 F2012   P9670    
ヤギ ラット血清   A9316     A8924      
ヤギ               アガロース
A6531
ミエローマタンパク質と交差
ヒツジ
F(ab')2
ヒト血清   A3563   F2883 A6782   Cy3
C2181
 
マウスIgG Fab ヤギ ヒトIgG   A1293   F5262 A9917      
マウスIgG (γ鎖) ヤギ   M1397 A3438 B7022 F8264 A3673      
マウスIgA (α鎖) ヤギ   M8769 A4937   F9384 A4789      
マウスIgM (μ鎖) ヤギ   M8644 A9688 B9265 F9259 A8786      
ラットIgG
(whole molecule)
ヤギ   R5130 A8438 B7139   A9037      
ウサギ ヒトIgG R3756 A6066   F1763 A5795   TRITC
T4280
 
ラットIgG2a マウス   R0761             モルモット免疫グロブリンと弱く交差
ラットIgM マウス   R0886             モルモット免疫グロブリンと弱く交差
ヤギIgG
(whole molecule)
ウサギ   G4018 A4187   F7367 A5420   TRITC
T7028
 
ニワトリIgY
(whole molecule)
ウサギ   C2288 A9171   F8888 A9046      
ヒツジIgG
(whole molecule)
ロバ   S2763 A5187   F7634 A3415