抗体101 (抗体基礎知識)

クロマチン免疫沈降法(ChIP)よくある質問

質問1:モノクローナル抗体とポリクローナル抗体のどちらを用いるべきでしょうか?

モノクローナル抗体とポリクローナル抗体のいずれもChIPに用いることができます。モノクローナル抗体は、高度に特異的であることが多いですが、架橋条件に敏感な場合もあります。架橋が過剰であると、標的エピトープが遮蔽されてしまう恐れがあるため、架橋を注意深く最適化する必要があるかもしれません。ポリクローナル抗体は、過剰な架橋などの条件にあまり敏感ではなく、同様なモノクローナル抗体よりも良好に濃縮可能である場合があります。しかし、ポリクローナル抗体は、非特異的標的に結合しやすくなっています。

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質問2:どうすれば選択した抗体がChIPで機能する可能性を高めることができますか?

抗体によって認識されるエピトープを検出するために、特異性/交差反応性を試験しましょう。ウェスタンブロット、免疫細胞化学、免疫沈降法などの複数の免疫アッセイにおいて抗体を試験する必要があります。その後、ChIPにおいて、その抗体を用い、標的のDNAが良好に濃縮されるかどうかを確認します。

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質問3:抗体の使用量はどれくらいですか?

標的タンパク質の存在量や、標的に対する抗体の親和性によって、2~10 μgのChIP抗体を用いることをお勧めします。抗体の量を増やせばシグナルも強くなるとは限りません。最良のChIPシグナルを得るためには、抗体の力価を適切に設定することが推奨されています。

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質問4:市販のChIP抗体は、どのように選択すればよいですか?

複数の特異性/交差反応性試験に合格しており、ChIPや複数の免疫アッセイにおいて検証済みの抗体を選択しましょう。ヒストン抗体のスクリーニングには、AbSurance™ histone antibody specificity Array(カタログ番号16-66516-66716-668)をお勧めします。

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質問5:実験に適切なChIP抗体がない場合、タグの使用は推奨されていますか?

IPにおけるタグ抗体の使用は、抗体が利用可能でない場合、ばらつきがある場合、架橋されたクロマチンにおいてエピトープが遮蔽されている場合に良い方法です。タグが転写因子の機能に干渉する可能性がありますので、 それぞれのケースでタグを評価する必要があります。N末端とC末端でタグを切り替えると、良いコントロールになる場合もあります。

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質問6:優れたコントロール抗体とは何ですか?

ChIP抗体と同一の種に由来する正常なIgGを用いることをお勧めします。もしマウスモノクローナル抗体を使用するならば、正常なマウスIgGをお勧めします。

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質問7:プロテインA/Gビーズブレンドを用いる利点は何ですか?

多数の抗体が、プロテインAおよびGの両方に結合しますが、親和性や特異性はそれぞれ異なります。プロテインAとGビーズを混合することによって、どちらか一方を選択したり、最適化のために両種に対する結合を評価したりする必要性がなくなります。ほとんどの場合において、プロテインA/Gビーズブレンドを用いると、純粋なプロテインAまたはプロテインG ビーズを同量用いた場合よりも良好な濃縮が得られ、バックグラウンド活性が減少することが認められています。

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質問8:正常なIgGコントロール抗体について、許容可能なインプット率(%)の範囲はどれくらいですか?

IgGプルダウンには相当なばらつきがあり、qPCRアッセイによって異なる場合もあります。同一のモックIgGサンプルでも、アッセイデザインの配列組成によって、ゲノムの別々の場所ではインプット率(%)の結果が異なる場合があります。シグナルは、チューブ、ビーズ、抗体に対する核酸の非特異的結合によるものである場合もあります。ChIPは相対的なので、特定のインプット率(%)に適合させるための試みは避ける方が良いでしょう。しかし、理想的には、モックIgGサンプルのCt値が、標準曲線において最も希釈されたサンプルに近い値である必要があります。同様に、ChIPは相対的であることから、ChIPシグナルがIgGシグナルよりも高い場合には(アッセイのばらつきの範囲内で)、ChIPの結果が陽性となります。

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