抗体101 (抗体基礎知識)

ELISA トラブルシューティング

問題1:シグナルが検出されない

考えられる原因1:使用した試薬が誤っている

解決法:特異的な試験ロットに対する試薬以外は使用されていないことを確認します。

考えられる原因2:試薬が損傷している

解決法:有効期限を過ぎた試験キットを使用してはいけません。

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問題2:シグナルが弱い

考えられる原因1:使用した試薬の希釈率が誤っている

解決法:使用する希釈率を慎重に調整します(通常用いられる希釈係数は100です)。

考えられる原因2:フィルターが誤っている(波長)

解決法:マイクロタイタープレート光度計の波長を確認します。

考えられる原因3:インキュベーション時間が短すぎる、温度が低すぎる

解決法:製品データシートで、ロットのインキュベーション時間に関する情報を確認します。(酵素基質のインキュベーション時間は、20~28℃の温度に適用されます);吸光度が1.0未満の場合は、基質のインキュベーション時間を延長します。

考えられる原因4:試薬の温度管理が誤っている

解決法:2日目に用いる試薬が、試験キットと用いる前に室温(20~28℃)に達していることを確認します。

考えられる原因5:アジ化ナトリウム、メルカプトエタノール、DTTは、高濃度ではペルオキシダーゼの活性に干渉する場合がある

解決法:アジ化ナトリウム、メルカプトエタノール、DTTを含有しないサンプル、または含有していても濃度が低い(0.1%未満)サンプル以外は使用しないようにしましょう。

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問題3:シグナルが高い

考えられる原因1:使用した試薬の希釈率が誤っている

解決法:使用する希釈率を慎重に確認します(通常用いられる希釈係数は100です)。

考えられる原因2:インキュベーション時間が長すぎる、温度が高すぎる

解決法:製品データシートで、ロットのインキュベーション時間に関する情報を確認します。(酵素基質のインキュベーション時間は、20~28℃ の温度に適用されます);吸光度が3.0超の場合は、基質のインキュベーション時間を短縮します。

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問題4:バックグランドが高い(ブランク)

考えられる原因1:洗浄ステップが不十分である

解決法:プレートを丁寧に洗浄し、各洗浄の後に液体を丁寧に除去します。

考えられる原因2:洗浄溶液のコンタミネーション

解決法:水が汚染されていないことを確認します。洗浄溶液の溶解や希釈には、必ず再蒸留水を用います。

考えられる原因3:過去の実験による試薬またはバイアル/チューブのコンタミネーション

解決法:試薬を今後の測定にも用いるのであれば、試薬のバイアルから直接ピペットで採取することは避けます。(酸化的な活性不純物は、非特異的な発色によって酵素基質に影響を及ぼす恐れがあります)。

考えられる原因4:使用した試薬(抗体および酵素標識体)の希釈率が誤っている

解決法:使用する抗体および酵素標識体の希釈率を慎重に確認します(通常用いられる希釈係数は100です)。

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問題5:実験の精度が低い (=ランダムエラー)

考えられる原因1:サンプルが不均一である(例、溶液が濁っている、サンプル中に粒子が認められる)

解決法:サンプルが、推奨されているサンプル調製手順に従い採取、調製、保存されていることを確認します(ポリプロピレンチューブ、透明なサンプルを-20℃で保存)。

考えられる原因2:サンプルや標準物質の混合が不十分である

解決法:ピペットで採取する前に、サンプルや標準物質を慎重に混合します。

考えられる原因3:サンプルおよび/または標準物質間のキャリーオーバー

解決法:各ピペット操作の後に、ピペットチップを交換します。

考えられる原因4:インキュベーション中の試薬の混合が不十分である

解決法:ピペット操作後に、試験プレートを慎重に揺らして試薬を混合します。試薬を至適に混合するためには、推奨されているステップでオービタルマイクロプレートシェーカーを用います。

考えられる原因5:洗浄が不十分である

解決法:自動マイクロタイタープレート洗浄器が、適切に機能していることを確認します。各洗浄ステップの後には、残っている液体を完全に除去しなければなりません。

考えられる原因6:液体が蒸発してしまう

解決法:インキュベーション中に、カバーシールがプレートと密着しているかどうか確認します。

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問題6:算出されたデータ値が高すぎる、または低すぎる
   (=システムエラー、「典型的なデータ」からのデータの逸脱)

考えられる原因1:希釈係数の計算が誤っている

解決法:データの計算で用いられたサンプルの希釈率の希釈係数を確認します。

考えられる原因2:試験手順が変更されている

解決法:製品データシートに記載されている指示(インキュベーション時間、希釈率など)に、慎重に従います。

考えられる原因3:サンプルの処理が誤っている

解決法:サンプルが、推奨されているサンプル調製手順に従い採取、調製、保存されていることを確認します(ポリプロピレンチューブ、透明なサンプルを-20℃で保存)。

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