抗体101 (抗体基礎知識)

フローサイトメトリー トラブルシューティング

問題1:データ取得速度が劇的に低下した

考えられる原因1:装置の流路が詰まっている

解決法1:サンプルを希釈し、解析される細胞数を減らします。細胞濃度が高すぎると詰まりが生じ、アッセイ中に混乱が生じる恐れがあります。

解決法2:何回も使用した後であれば、標準的なフローサイトメーターでは流路系を洗浄する必要があります。標準的な洗浄手順を実施し、アッセイ中または後に液体システムを清掃します。これによって、一定の流れが生じる場所に沈着等が形成されることが防止されます。

解決法3:キャピラリー流を保つためにフローセルはきれいで詰まりがないことを確認してください。洗浄やメンテナンスは製品取扱説明書に従ってください。

考えられる原因2:細胞が凝集してしまう

解決法:付着または接着性の細胞では、細胞凝集が生じることがあります。セルストレーナー(カタログ番号 SCNY00060; 60 μm)の使用も、細胞凝集を阻止する助けとなります。

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問題2:シグナルが失われてしまっている、またはシグナルが認められない

考えられる原因1:サンプル中の細胞数が十分ではない

解決法:洗浄ステップでは、細胞が失われることがよくあります。上清を流すあるいは吸引して除く前に細胞ペレットがしっかりしていることを確認してください。ペレットへ接触しないよう、吸引中はプレートやチューブの角度を変えてください。

考えられる原因2:抗体が十分ではない

解決法:シグナルの欠如は、染色手順で想定よりも多量の抗体を用いる必要性を示している場合があります。理想的な染色濃度を把握するため、一部の細胞のタイプでは、さらに抗体の力価を測定する必要があるかもしれません。

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問題3:バックグラウンドおよび/または細胞の非特異的な染色

考えられる原因:抗体が過剰である

解決法:抗Fc受容体抗体または血清ベースのブロッキング剤であらかじめ細胞をブロッキングしてください。抗体処理中もブロッキングを維持します。特異的な染色の適切な濃度を見つけるために抗体の希釈系列をテストしてください。

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問題4:実験ロット間の結果のばらつき

考えられる原因1:細胞生存率の変化

解決法:実験に用いる培養細胞をモニタリングし、解析対象の細胞生存率や細胞数が安定していることを確認します。

考えられる原因2:機器の校正の変化

解決法:使用前に、日常的に機器の品質確認(例、キャリブレーション)を実施します。

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