抗体101 (抗体基礎知識)

免疫染色法(ICC/IHC)トラブルシューティング

問題

  1. 染色が認められない
  2. 組織の染色が過剰
  3. バックグラウンドが高い

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問題1:染色が認められない

考えられる原因1:抗原が認められない

解決法:該当する組織において対象のタンパク質が存在しているかどうか、文献を確認します。または、in situ ハイブリダイゼーションによってmRNAの発現を確認します。

考えられる原因2:抗体の保存が不適切

解決法:抗体は分注し、小容量で保存します。製造業者の指示に従い保存しましょう。凍結・融解の繰り返しを避けます。

考えられる原因3:組織の固定が不十分

解決法:別の固定法を試すか、固定時間を変更します。

考えられる原因4:組織の固定が過剰

解決法:固定時間を短縮するか、組織を室温ではなく4℃で固定します。

考えられる原因5:一次抗体と二次抗体の適合性がない

解決法:一次抗体と相互作用する二次抗体を使用します。

考えられる原因6:二次抗体溶液に不良がある

解決法:新鮮な抗体試薬を調製します。

考えられる原因7:酵素‐基質反応性;基質バッファーのpHが不適切

解決法:脱イオン水は、酵素活性を低下させるペルオキシダーゼ阻害剤を含有している場合があります。特定の基質に対して推奨されているpH範囲のバッファーを使用します。

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問題2:組織の染色が過剰

考えられる原因1:一次および/または二次抗体の濃度が高すぎる

解決法:至適な濃度を判定し、さらに低い濃度を試してみます。

考えられる原因2:インキュベーション時間が長すぎる

解決法:インキュベーション時間を短縮してみましょう。抗体、基質、酵素など、それぞれを用いて時間を最適化します。

考えられる原因3:一次および/または二次試薬による組織への非特異的結合

解決法:非特異的結合を最小化または阻害するために組織を処理します。

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問題3:バックグラウンドが高い

考えられる原因1:インキュベーション混合液に含まれている内因性分子が、組織中にも高レベルで存在している可能性がある。例として、血球細胞中のペルオキシダーゼが、組織に残留している場合がある

解決法1:一次抗体の供給源とは異なる種に由来する正常血清とインキュベーションしてみましょう。

解決法2:干渉するペルオキシダーゼが含まれている組織に対しては、0.3%過酸化水素を含有するメタノール中で、室温で30分間処理します。

考えられる原因2:二次抗体による交差反応性または非特異的結合

解決法:二次抗体が、標的以外の抗原が有する同一のまたは類似エピトープに強度または中程度の親和性を示す場合があります。例として、スライドのコーティングに用いられることがある卵白は、アビジンを大量に含有しています。染色中にアビジンがビオチン化二次抗体に結合することを防止するため、卵白の使用は避けましょう。

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