抗体101 (抗体基礎知識)

免疫沈降法(IP)トラブルシューティング

問題1. バックグラウンドが高い

考えられる原因1:細胞溶解液中の汚染タンパク質

解決法1:一次抗体を加える前に、細胞溶解液をプロテインA/G アガロースビーズで事前に精製します。

解決法2:飽和量の、BSA、ゼラチン、アセトン粉末、または脱脂粉乳などの競合タンパク質を加えます。

解決法3:一次抗体を加える前に、細胞溶解液を100,000×gで30 分間遠心します(ペレットは廃棄)。

考えられる原因2:抗体溶液中の夾雑物

解決法:抗体を、100,000×gで30分間遠心分離し(ペレットは廃棄)、力価を設定します。

考えられる原因3:沈降用抗体の特異性が低い

解決法:別の抗体を試します。

考えられる原因4:洗浄回数が不十分である

解決法:洗浄回数を増やします。洗浄ごとに、固相を洗浄バッファーに10分間「浸漬」します。

考えられる原因5:抗体が多すぎる

解決法:一次抗体の濃度を低くします。

考えられる原因6:インキュベーションが長すぎる

解決法:一次抗体とのインキュベーション時間を短縮します。

考えられる原因7:二次抗体が非特異的に結合する

解決法:ウサギ抗マウス免疫グロブリン(沈降用二次抗体)をモノクローナル抗体と組み合わせて用いている場合は、沈降用二次抗体のみによるバックグラウンドを確認しましょう。必要に応じて力価を設定します。

考えられる原因8:プロテインA/Gビーズがバックグラウンドを引き起こしている

解決法:バックグラウンドバンドが、プロテインA/Gビーズまたは抽出液によるものかどうかを判定するために、ウェスタンブロット解析中に、一次抗体を用いず、プロテインA /Gのみで沈降処理を行ったネガティブコントロール実験を実施します。

考えられる原因9:計数パラメータを最適化する必要がある(放射活性アッセイ)

解決法:使用した放射性標識の1分間あたりのカウント数(cpm)を、抗原の検出に必要な最小値まで下げます。

TOPへ戻る>>

問題2:ウェスタンブロット解析で複数のバンドが検出される

考えられる原因1:抗原が1つ以上のポリペプチド鎖からなっている、または付加的なポリペプチドを付随している。

解決法:共に免疫沈降される付加的なタンパク質は、抗原の相互作用について理解する際に有用であることが多いため、問題とみなすべきではありません。

考えられる原因2:共に溶出された捕捉抗体の重鎖または軽鎖が、標的タンパク質の検出に干渉している。

解決法:抗体の共溶出を避けるために、架橋IP(捕捉抗体をプロテインA/Gに共有結合的に接合)を用います。

TOPへ戻る>>

問題3:予測される分子量以下で複数のバンドが検出される

考えられる原因1:プロテアーゼ阻害剤カクテルの劣化などにより、サンプルがタンパク質分解を生じている可能性がある。

解決法:新鮮なプロテアーゼ阻害剤を添加し、新しい細胞溶解液を調製します。このステップには、プロテアーゼ阻害剤カクテルを用いることもできます。

TOPへ戻る>>

キャンペーン対象製品をキーワードで探せる - キャンペーンファインダー 新製品をキーワードで探せる - 新製品ファインダー