抗体101 (抗体基礎知識)

マルチプレックスビーズベースアッセイ トラブルシューティング

問題1:測定されたビーズの数が不十分である

考えられる原因1:プレートウォッシャーの吸引高の設定値が適正ではない

解決法:製造業者の指示に従い、吸引高を調節します。

考えられる原因2:ビーズミックスの調製が不適切である

解決法:プロトコールに従い、ビーズミックスのボトルに加える直前に、ビーズのバイアルを超音波処理し、ボルテックスします。ピペットを用いてビーズミックスをプレートに入れる間、リザーブ容器内でビーズミックスを断続的に撹拌します。

考えられる原因3:サンプル中の粒子状物質や粘度のために干渉が生じてしまう

解決法:上記参照。また、サンプルプローブをアルコールフラッシュ、バックフラッシュ、洗浄で清掃する必要がある場合があります。または、必要に応じてプローブを取り出して超音波処理します。

考えられる原因4:サンプル中の粒子状物質や粘度のために干渉が生じてしまう

解決法:上記参照。また、サンプルプローブをアルコールフラッシュ、バックフラッシュ、洗浄で清掃する必要がある場合があります。または、必要に応じてプローブを取り出して超音波処理します。

考えられる原因5:サンプルプローブの高さが正しく調節されていない

解決法:製造業者の指示を参照します。Luminex 200装置でアッセイの測定を行う場合には、Luminex社が推奨するプロトコールに従い、4つのアライメントディスクを用いてキットの固相プレートに合わせ、サンプルプローブの高さを調節します。FLEXMAP 3D装置でアッセイの測定を行う場合には、Luminex社が推奨するプロトコールに従い、1つのアライメントディスクを用いてキットの固相プレートに合わせ、サンプルプローブの高さを調節します。MAGPIX® systemでアッセイの測定を行う場合には、Luminex社が推奨するプロトコールに従い、2つのアライメントディスクを用いてキットの固相プレートに合わせ、サンプルプローブの高さを調節します。

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問題2:バックグラウンドが高すぎる

考えられる原因1:バックグラウンドのウェルが汚染されている

解決法:シーラーを適切に用い、プレートの試薬に触れないようにマルチチャネルピペットを用いてピペット操作することによって、ウェル間のコンタミネーションを避けます。

考えられる原因2:洗浄が不十分である

解決法:洗浄回数を増やします。

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問題3:ビーズが領域またはゲート内にない

考えられる原因1:Luminex装置が正しく、またはしばらく校正されていない

解決法:装置の製造業者の指示に基づき、少なくとも週1回、または温度が3℃超変化した場合に、Luminex装置を校正します。

考えられる原因2:ゲート設定が正しく調節されていない

解決法:一部のLuminex装置では、キットのプロトコールに記載されているゲート設定とは異なる設定が必要となる場合があります。装置のデフォルト設定を使用します。

考えられる原因3:プロトコールのテンプレートのビーズ領域が間違っている

解決法:キットのプロトコールで、正しいビーズ領域または分析対象の選択を確認します。

考えられる原因4:使用したサンプルの種類が間違っている

解決法:有機溶剤を含有するサンプルや、粘度の高いサンプルは、必要に応じて希釈または透析します。

考えられる原因5:装置が洗浄、または準備されていない

解決法:Luminex装置を4回気泡除去操作して準備を行い、アルコールや消毒液が残っている場合には、シース液か水で4回洗浄します。

考えられる原因6:ビーズが露光してしまった

解決法:すべてのインキュベーションステップ中は、プレートやビーズミックスを暗色のフタかアルミホイルで覆っておきます。

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問題4:プレート全体のシグナルがバックグラウンドと同じである

考えられる原因1:検出が不正確、または検出されない

解決法:適切な検出抗体を加えて継続します。

考えられる原因2:抗体が添加されている

解決法:検出に競合する抗体がサンプル中に含まれていないことを確認してください。

考えられる原因3:ストレプトアビジン‐フィコエリスリンが添加されていない

解決法:プロトコールに従い、ストレプトアビジン‐フィコエリスリンを加えます。

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問題5:細胞溶解液の陽性コントロールのシグナルが低い

考えられる原因:インキュベーションの際に温度、タイミング、または撹拌が不適切であった

解決法:アッセイ条件を確認する必要があります。

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問題6:サンプルのシグナルが高すぎて飽和している

考えられる原因1:キャリブレーションターゲット値の設定が高すぎる

解決法:一部のLuminex装置では、RP1校正物質に対するデフォルトのターゲット設定が高PMTに設定されています。キャリブレーションに低いターゲット値を用い、プレートを再度分析します。

考えられる原因2:細胞溶解液のコントロールやサンプルを用いたプレートのインキュベーションが長すぎた

解決法:インキュベーション時間を短縮します。

考えられる原因3:サンプル中の分析対象の濃度が、アッセイのダイナミックレンジよりも高い

解決法:特定の分析対象のために、サンプルを希釈し、再度分析する必要がある場合もあります。

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問題7:サンプルのシグナルが低すぎる

考えられる原因1:サンプル中に分析対象が含有されていない、または検出レベル未満である

解決法:シグナルが検出レベル未満である場合には、サンプル容量を増やすこともできます。プロトコールの適切な修正に関しては、テクニカルサポートに確認してください。

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問題8:サンプルおよび/ または標準物質のばらつきが大きい

考えられる原因1:マルチチャネルピペットが校正されていない

解決法:ピペットを校正します。

考えられる原因2:プレートが均一に洗浄されていない

解決法:すべての洗浄ステップにおいて、すべての試薬が完全に除去されていることを確認します。

考えられる原因3:サンプル中に粒子状物質やその他の干渉物質が多く含有されている

解決法:上記参照。

考えられる原因4:プレートの攪拌が不十分である

解決法:すべてのインキュベーションステップ中は、垂直方向のプレートシェーカーを用い、ビーズが常に揺れ動きながらも飛び散らないスピードでプレートを撹拌します。

考えられる原因5:ウェル間のコンタミネーション

解決法1:プレートシーラーを再利用する場合には、試薬がシーラーに接触していないことを確認します。

解決法2:試薬の添加に使用したピペットチップを用いる場合には、ピペットチップがプレートの試薬に接触しないよう注意する必要があります。

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