ウェスタンブロッティング（WB）トラブルシューティング

解決法：タンパク質濃度を正確に測定し、泳動するタンパク質の量を減らします。

解決法：ゲルの平衡化時間を確認します。

解決法：ゲルに泳動する抗原を増やすか、または泳動前にサンプルを濃縮する、またはゲルに泳動する標的タンパク質の量を増やすために免疫沈降法を用います。

解決法：電気泳動用の処理によってサンプルの抗原性が破壊されていないか確認します。

解決法：リプロービング中に抗原が失われている可能性があります。

解決法：バッファーからTween^® を除きます。

解決法：適切な二次抗体であるか確認します。

解決法：新鮮なブロットを用います。

解決法１：一次抗体の濃度、インキュベーション時間、および温度を最適化します。

解決法２：特定のアプリケーションに際して、試薬濃度を上げインキュベーション時間を延長します（および最適化します）。

解決法３：検出試薬が適切に保存されており、指示どおりに使用されていることを確認します。

解決法：露光時間を延長します。

解決法：少量の作業溶液（1 mL）を調製し、暗室で1 mL のHRP 標識体を添加します。化学発光基質が正常であれば視覚可能な青い光が認められるはずです。

解決法１：ゲルに泳動するタンパク質を増やすか、または泳動前にサンプルを濃縮する、またはゲルに泳動する標的タンパク質の量を増やすために免疫沈降法を用います。

解決法２：フィルムの露光時間を延長します（1～2時間）。

解決法３：メンブレンへのタンパク質の転写不良が疑われる場合には、転写バッファーのpH、メンブレンの種類や電位などの転写条件を最適化します。

解決法：目的タンパク質が低分子量（＜ 20 kDa）の場合、孔径0.2 μm のメンブレンImmobilon-P^SQ（カタログ番号 ISEQ00010 他）を選択することをお勧めします。

解決法：ブロッキングタンパク質の濃度を下げます。濃度5% のスキムミルクでは検出できなかったバンドが、0.5%、0.05% のもので検出できるようになることがあります。

解決法：より高感度の検出試薬Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate(カタログ番号 WBULS0100) 、もしくはシグナル増強剤Immobilon Signal Enhancer (カタログ番号 WBSH0500) を使用します。

解決法：転写後に、ブロットを撹拌しながらよく洗浄します。

解決法：抗体濃度を下げます。

解決法：泳動するタンパク質の量を減らします。

解決法：抗体濃度を下げます。

解決法：アプライするタンパク質量を減らします。

解決法：二次抗体濃度を下げます。

解決法１：転写中にゲルとメンブレンの間にある気泡を取り除きます。

解決法２：ブロッキング前に、Ponceau S ( カタログ番号 114275) で膜を染色してタンパク質の転写をチェックします。

解決法３：ストリッピング中にメンブレンが重なり合わないように、メンブレンを別々にインキュベーションします。

解決法１ ：ブロッティングサンドイッチを作製する際、丁寧に気泡を除去します。

解決法２：エレクトロブロッティングの間に温度が過剰になり、気泡またはゲル／メンブレンの歪みが生じていないか確認します。

解決法：機器（ボックス、トップ、電源）の設定を確認します。

解決法：メンブレンがゲルの正しい面の上にあることを確認します。

解決法１：手順を通して、メンブレンがしっかりと濡れたままであることを確認します。

解決法２：すべてのインキュベーション中には撹拌するようにします。メンブレンの取扱いに気を付けましょう―メンブレンを傷つけると、非特異的結合が生じる恐れがあります。

解決法３：メンブレンを素手で取り扱わないようにします。グローブを着用しましょう！

解決法４：常に清潔なグローブを着用するか、メンブレン用ピンセット（カタログ番号 XX6200006P）を用います。

解決法：一次抗体または二次抗体のいずれかの希釈率を下げる、またはインキュベーション時間を短縮します。

解決法：別のブロッキング剤と比較します。

解決法１：ブロッキング剤の濃度を上げます。

解決法２：ブロッキング時間および温度を最適化します。ブロッキング剤にTween^®-20 が含まれていない場合、Tween-20 を添加します。Tween-20 の濃度は0.05% が推奨されています。

解決法１：別のブロッキング剤を用います。一次抗体を、その他のタンパク質を含まないブロッキング剤で希釈します。

解決法２：アビジン‐ ビオチンシステムを用いる場合は、メンブレンのブロッキングにスキムミルクは使用しません。

解決法３：新しく調製したブロッキング剤を用います。

解決法１：ブロットをフィルムに露光する時間を短縮します。

解決法２：フィルムの露光時間を最短にします（最初の15秒の露光で十分な場合もあります）。露光時間が短すぎると不便である場合は、抗体濃度を下げます。

解決法３：フィルムに再度露光する前に、ブロットをカセット内で5～10分放置します。

解決法１：洗浄回数や、使用するバッファーの容量を増やします。

解決法２：バッファーにTween-20が含まれていない場合、Tween-20を添加します。例えば、PBS-T (カタログ番号 524653)、あるいはTBS-T(カタログ番号 524753) を使用します。

解決法３：ブロッキング剤のTween-20濃度を0.1% に上げます。

解決法４：Tween-20含有バッファーでの洗浄でも不十分な場合、塩化ナトリウム（最大0.5 M）およびSDS（最大0.02%）を添加したPBS あるいはTBS などのバッファーで、二次抗体反応後に30 分間振とう洗浄を行います。

解決法：新鮮なバッファーを調製します。

解決法：すべての機器を清掃するか、交換します。

解決法：抗体濃度を最適化します。一次／二次抗体の濃度が高すぎると、高いバックグラウンドが生じる場合があります。

解決法：標識抗体を、孔径0.2 μ m のメンブレン（カタログ番号 SLGVJ13SL）でろ過します。

解決法：別のブロッキング剤と比較します。

解決法１：ブロッキング剤の濃度を上げます。

解決法２：ブロッキング時間および／または温度を最適化します。

解決法３：ブロッキング剤にTween-20が含まれていない場合、Tween-20を添加します。Tween-20の濃度は0.05% が推奨されています。