抗体

ウェスタンブロッティングのローディングコントロール

Chandra Mohan, PhD; Wayne Speckmann, PhD; Robin Clark, PhD, MilliporeSigma, Temecula, CA

ウェスタンブロッティングについて記載した最初の論文以来(Renart et al., 19791)、この免疫検出技術は、細胞または組織から抽出された複雑な混合物中の特定タンパク質を同定するために広く利用されています。ウェスタンブロッティングには3つの基本的な要素があります。
タンパク質の大きさによる分離1、固体支持体への転写2、適切な一次抗体を用いて標的タンパク質を標識し、続いて一般的には共役二次抗体を用いた可視化3です。その後のツールと技術の改良は、高感度の蛍光ラベルの開発とともに、検出限界を有意に高め、研究者が組織特異的な正常および疾患経路を調査できるようになりました。しかし、タンパク質レベルの変化を同定する定量的ウェスタンブロットを行う際、研究者はいつもいくつかの困難に直面します。これは、多くのタンパク質が異なる組織において、異なる生理学的および病理学的条件下で異なる発現パターンを示すことによります。

ウェスタンブロッティング:単純ではないルーティン手法

ウェスタンブロッティングは恐らく世界中の研究室で最も一般的に使用されている免疫アプリケーションですが、慢性的に見落とされる可能性があるいくつかの重大な技術的問題が依然として存在します。例えば、単離または分離プロトコールはタンパク質の完全性またはその翻訳後修飾に影響するでしょうか?タンパク質の分解または凝集と生物学的過程の関連産物とを区別できるでしょうか?結果が複数のバンドの場合、どのようにして結果、バリエーション、アーティファクトを判別できるでしょうか? (Gorr and Vogel, 20155

定量的ウェスタンブロットは異なる個体、治療条件、病状、または他の生物学的変数を表す一群のサンプル中の標的タンパク質の相対量を比較するために使用されます。複数サンプルの総タンパク質レベルを正確に識別して測定するために、研究者は内部標準として「ローディングコントロール」を使用できます。このコントロールは、すべてのサンプル中に存在すると推定され、その相対存在量が生物学的変動または実験条件によって影響されないタンパク質に対する一次抗体の添加を指します。ローディングコントロールのための一般的に良い候補のタンパク質は、偏在的に発現される「ハウスキーピング」遺伝子産物です。ローディングコントロールの使用は、ローディングコントロールが異なるサンプルレーン間で同一という仮定のもと、結果を標準化するために全てのウェルにわたるサンプルローディングの定量化を可能にします。ローディングコントロールを使用すると、「エッジ効果」(多数のレーンを使用した場合に一般的に見られる状態)から保護され、外側のレーンのタンパク質は、フレームに近い位置でメンブレンに転写され、ブロットの端でより強い染色を引き起こします。ローディングコントロールは、タンパク質をローディングするのに変動が起こったかどうかを示すのに使用でき、標的のバンドで観察された変動を説明できます。正しく使用すると、ローディングコントロールにより、ウェスタンブロットのすべてのレーンでローディング量にわずかな違いがあるにもかかわらず、タンパク質が適切に定量されます。

抗β-アクチンモノクローナル抗体(A5316)のウェスタンブロット検証
β-アクチン、β-チューブリン、GAPDHなどの構成的に発現されるタンパク質は、定量的ウェスタンブロッティング用のローディングコントロールとしてよく選ばれます。ローディングコントロールの使用は、標的タンパク質の存在量の明らかな変動が、関連する生物学的な変動に起因するものであり、ゲルにロードされた総タンパク質量の不一致によるものではない、ということを確実にするのに役立ちます。下記の表は、ウェスタンブロッティングのローディングコントロールとして有用なサンプルおよび条件特異的な抗体を示しています。

ローディングコントロール抗体の選択

βアクチンおよびβチューブリンは、それらの発現がほとんどのモデル系で比較的構成的であるため、ローディングコントロールとして一貫して使用されています。しかし、いくつかの論文はβアクチンおよびβチューブリンのレベルが組織間で異なり、それらの発現が病態によって影響を受ける可能性があるという理由で、標準的なローディングコントロールとしてβアクチンを使用することの妥当性を疑問視しています(Ditmar and Ditmar, 20062; Eaton et al., 20133; Li and Shen, 20134)。これらの論文の著者らは、定量的ウェスタンブロッティングにおける代替技術として全タンパク質分析を示唆しており、 「ハウスキーピング」遺伝子産物は実験中の遺伝子の発現パターンを研究した後に慎重に使用すべきであると推奨しています。それにもかかわらず、β-アクチンとβ-チューブリンはローディングコントロールとして一定の利点を提示します:それらは高度に保存されており、高い発現レベルを示し、ほとんどの実験条件下で安定性を示します。研究されている特定の組織または細胞に基づいてコントロールを選ばなければならないことに注意することは重要で、ローディングコントロールの均一性を検証するために、実験に基づいたテストが必要になるでしょう。

ローディングコントロール抗体から効果的な結果を得るためのヒント

ウェスタンブロッティングのばらつきを克服し、データ解釈の誤解を減らすために、以下の予防策が役立つでしょう。

  • 安定的に発現し、実験条件による影響を最小限にとどめる内部ローディングコントロールを使用する。
  • サンプル中に構成的に発現していることが知られているタンパク質に対するローディングコントロール抗体を選択する。
  • 1つ目のコントロールで得られた結果を実証するために、2つ目のローディングコントロールを利用する。これは新しいもしくは新規のサンプルで特に価値があります。
  • ローディングコントロールは広範囲の分子量をカバーしなければなりません。そのため、選択されたコントロールは、標的タンパク質と同じ分子量レンジではなく、類似の分子量レンジになります。これにより、標的のバンドとコントロールバンドの両方がブロット上で簡単に区別できるようになります。
  • ローディングコントロール抗体は、大量に発現しているハウスキーピングタンパク質を検出していることが多く、特に化学発光検出法を使用する場合はシグナル飽和を引き起こします。過飽和は参照としてローディングコントロールバンドが役に立たず、標的タンパク質量のサンプル間のばらつきを隠す可能性があります。

ローディングコントロールシグナルが検出の直線範囲内であることを確認するために、開始する前に使用するサンプルでローディングコントロールの抗体濃度およびブロット暴露時間を調整しましょう。

表1:ローディングコントロール例
 

Loading Control Molecular Weight (kDa) Suitable for Notes
b-Actin 43 全細胞および
細胞質抽出物
骨格筋のようにアクチンレベルの高い組織には使用しないでください。
Glyceraldehyde 3-phosphatase dehydrogenase (GAPDH) 35 全細胞および
細胞質抽出物
発現レベルは、組織の種類や病状によって異なります。
b-Tubulin 50 全細胞および
細胞質抽出物
発現は通常生物種間で一貫しています。 発現は細胞分裂抑制薬の影響を受ける可能性があります。
Voltage-dependent anion channel protein 1 (VDAC1) 31 ミトコンドリア VDAC1はアポトーシスを起こしている細胞内でオリゴマー化する可能性があります。 腫瘍細胞はより高レベルのVDAC1を示すことがあります。
Cytochrome c Oxidase 16 ミトコンドリア サンプルは血漿タンパク質に汚染される可能性があります。 したがって、ミトコンドリアを単離するために適切な勾配を使用してください。 複数のサブユニットがあり、これらのサブユニットの発現は組織の種類によって異なります。
HSP60 60 ミトコンドリア HSP60レベルは酸化ストレスまたは温度ストレスによって変化します。 腫瘍細胞は高レベルのHSP60を示します。
Lamin B1 66 核膜 生物種を超えて高度に保存されています。 細胞老化の良いマーカーです。
TATA-binding protein (TBP) 38 TBPはDNAおよびその他の核成分が除去された場合のローディングコントロールとして推奨されません。
Histone H2B 14 ヒストンレベルは細胞分裂の前に増加します。 したがって、S期とS期前の細胞との比較には適していません。 細胞同期をお勧めします。
Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) 36 PCNAはDNA損傷経路の活性化により急速に分解されます。
Transferrin 75 血清 トランスフェリンレベルは、鉄欠乏の条件下で高く、肝臓病において低いです。

 

表2:抗体コントロールオプション
 

カタログ番号 製品名 交差性 アプリケーション
A5441 Anti-β-Actin antibody, Clone AC-15 Multiple mammalian species ELISA, WB, IHC, IF
A2066 Anti-Actin antibody, Rabbit polyclonal Human, other vertebrates IF, IHC, WB
05-661 Anti-β-Tubulin Antibody, clone AA2 Human, Rat, Mouse, Bovine WB
CB1001 Anti-GAPDH, Clone 6C5 Multiple mammalian species ICC, WB
G8795 Anti-GAPDH antibody, Clone GAPDH-71.1 Multiple mammalian and avian species ELISA, ICC, WB
G9545 Anti-GAPDH antibody, Rabbit polyclonal Human, Mouse, Rat IF, IP, WB
AB10526 Anti-COX4 (Cytochrome c Oxidase), Rabbit polyclonal Human IHC, WB
PLA0269 Anti-HSP60 Antibody, Rabbit polyclonal Multiple mammalian species IF, IHC, IP, WB
07-371 Anti-Histone H2B, Rabbit polyclonal Human, Chicken WB
05-1352 Anti-Histone H2B, Clone 5HH2-2A8 Human, Mouse, Rat ICC, WB
MABE288 Anti-PCNA, Clone PC10   Human IF, IHC, WB

 

References

  1. Renart, J et al. (1979). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76:3116-3120.
  2. Dittmer A and Dittmer J. (2006). Electrophoresis. 27(14):2844-2845.
  3. Eaton, SL et al. (2013). PLOS One. doi.org/10.1371/journal.pone.0072457.
  4. Li, R and Shen, Y (2013). Life Sci. 92(13); 747-751.
  5. Gorr, TA and Vogel J (2015). Proteomics Clin. Appl. 9(3-4); 396-405.