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3D細胞培養

アニマルフリーで3D培養 TrueGel3D™

3D培養とは?

3次元培養 (3D)

細胞が立体的に増殖可能
生体内に近い構造で研究可能

従来の培養 (2D)

細胞が平面に増殖
生体内の立体的な環境とは異なる

3次元培養 (3D) で期待できる研究

  • オルガノイド作成
  • 再生医療
  • 薬物動態
  • 細胞相互作用

従来の平面的な培養では行えなかった組織の形成や、生体内に近い立体的な環境下での薬物動態の分析、細胞間相互作用の研究など、3D培養ならではの研究成果が期待されています。

製品の特長

  • 他種類の細胞で実績のある3D培養用ゲル
  • 細胞に影響を与えないアニマルフリーの組成
  • 透明で観察しやすい
  • 用途に応じた複数のキット

TrueGel3Dはアニマルフリーの化合物で構成されたハイドロゲルです。ポリマーとクリスリンカーを混合するとゲルが形成されます。

TrueGel3Dは動物由来成分を含まないため、実験結果の分析を妨げたり、細胞を汚染したりする可能性がありません。さらに、TrueGel3Dに含まれるコンポーネントは生存性を保持し、自然の細胞外マトリックス(ECM)の重要な機能を模倣することができます。

TrueGel3Dテクノロジーは、3D環境での細胞の形態学的および生理学的特性を調べるためのツールとして有用です。

実例

TrueGel3DはMDCK細胞、上皮細胞、線維芽細胞、癌細胞、リンパ球、初代細胞、間質細胞および胚性心筋細胞など多くの細胞種で実績があります。

(1) MDCK細胞のシスト形成

TrueGel3D FAST-PVAハイドロゲルにRGD integrin adhesion peptideを加えた15日間の培養 (A) は細胞単層の内腔が観察されました。
TrueGel3D FAST-PVAハイドロゲルにscrambled RGD peptideを添加した場合 (B) はMDCKシストは内腔が見られましたが、偏極した細胞は見られませんでした。
TrueGel3D FAST-PVAハイドロゲルにthioglycerolを添加して増殖したMDCKは、管腔も偏極した細胞も見られませんでした。緑:核。赤:アクチン細胞骨格。

詳細はこちらをご覧ください。

(2) 3T3線維芽細胞

PEG非細胞分解性クロスリンカーを含んだTrueGel3Dハイドロゲル(A)で増殖した3T3線維芽細胞は、丸く、緻密に凝集した凝集体を生じ、CD-細胞分解性クロスリンカーを含んだTrueGel3Dハイドロゲル(B)で増殖した細胞は広がって増殖しました。(A),(B)ともにRGD integrin adhesion peptideを加えています。赤:核。緑:アクチン細胞骨格。

詳細はこちらをご覧ください。

(3) 腫瘍細胞と間質細胞の共培養

TrueGel3Dハイドロゲル中でMCF-7乳癌細胞株を単独で培養した場合は腫瘍様のスフェロイドを形成し (A)、ヒト真皮線維芽細胞を単独で培養した場合は伸びた状態(B)が見られました。TrueGel3Dハイドロゲルで両方の細胞を共培養した場合、14日後になっても生理学的および形態学的特徴を保持し、腫瘍微小環境を研究するための腫瘍-間質モデルとなる状態が観察されました(C)。 (A),(B),(C)いずれもRGD integrin adhesion peptideを加えています。赤:アクチン細胞骨格。緑:核。

詳細はこちらをご覧ください。

構造

TrueGel3Dの骨格になるポリマー
ポリビニルアルコール (PVA) またはデキストラン

クロスリンカー
ポリエチレングリコール (PEG) または分解可能なクリスリンカー (CD)

ご用意していただく細胞
キットに付属していません

足場ペプチド(細胞の接着・移動用)
RGDペプチド

TrueGel3Dによる3D培養は次の4つのコンポーネントで構成されています。

(1) TrueGel3Dポリマー:ポリビニルアルコール(PVA)またはデキストラン
(2) クロスリンカー:クロスリンカーは両端にあるチオール基でポリマー上のチオール反応基と結合します。そうすることでポリマー鎖を連結し、ゲルを形成します。2種類のクロスリンカー(1)PEGもしくは(2)CD (cell-degradableよりお選び頂けます。
(3) 接着因子:マトリックスへの細胞接着や細胞の移動が必要な場合、TrueGel3D Arg-Gly-Asp(RGD)インテグリン接着ペプチドのような接着配列を含むペプチドをゲルに加えることができます。細胞外マトリックスタンパク質(例えば、フィブロネクチン、ラミニン)、ペプチド、ヘパラン硫酸または成長因子(キットに含まれない)など他の生理活性物質の添加も可能です。
(4) ご用意していただく細胞(キットには含まれません)

使い方とプロトコール

TrueGel3Dキットの試薬と細胞を混ぜるだけで3D培養スタート

ポリマーをミックス > ペプチドをミックス > 細胞をミックス > クロスリンカーによりゲル化 > 培養

PVAまたはデキストランでベースが作られます

 

マトリックスへの細胞接着や細胞の移動が必要な場合はRGDペプチドを添加します

 

ご自身でご用意した細胞をお使いください

 

細胞が分解できないクロスリンカー(PEG)と細胞が分解できるクロスリンカー(CD)をご用意しています

 

プレートに移して液体培地でインキュベートします

       

上記はゆっくり固まるタイプTrueGel3Dキット (製品番号TRUE6-1KTなど) の手順紹介です。
速く固まるタイプのTrueGel3Dキットの場合は、クロスリンカーをあらかじめプレートに分注し、そこに細胞とポリマー、ペプチド (ペプチドはオプション) のミックスを添加し、そのままプレート上でゲルが形成されます。

尚、TRUE1-1KT以外のキットにはRGDペプチドは含まれておりません。(別売)

 

ゆっくり固まるタイプの使用イメージ

 

プロトコールは下記をご覧ください。
プロトコール1: Preparation of TrueGel3D™ hydrogel, CD cell-degradable crosslinker and RGD peptide (TRUE1)
プロトコール2: Preparation of Fast hydrogels (TRUE2-TRUE5)
プロトコール3: Preparation of Slow hydrogels (TRUE6-TRUE9)
プロトコール4: ハイドロゲルのオプション(ペプチドの追加とゲルの硬さ調節)(英語ページ)
プロトコール5: Cyst Formation of MDCK Cells
プロトコール6: Co-Culture of Tumor and Stromal Cells
プロトコール7: Utilization of Truegel3D Hydrogels to study Fibroblast Spreading

「動画: Beating Cardiac Muscle Cells」

製品の選び方

多様なキットとオプションをご用意

速く固まるゲルとゆっくり固まるゲル

実験を急ぎで進めるなら速く固まるゲル、時間をかけて行いたい場合はゆっくり固まるゲルがおすすめです。
デキストランとPVAの2種類のポリマーどちらにも速いタイプとゆっくりのタイプをご用意しています。

ゲルの固まる速度 アプリケーション例
Slow (10分以内) マイクロチャンネル、インジェクション用シリンジ、ゲル剛性試験、硬質ヒドロゲル
Moderate (4分以内) 腫瘍-間質共培養、スフェロイド形成、シスト・腺房形成
Fast (1分以内) 迅速な培養条件、大きな組織サンプルの埋め込み

細胞とマトリックスの相互作用をもたらすRGDペプチド

顕微鏡検査用の細胞または組織の固定化などのアプリケーションでは、TruGel3Dキットに追加のオプションなしで使用できます。
細胞の接着と拡散にはTrueGel3D RGDペプチドが必要です(CD分解性クロスリンカーの存在も細胞の拡散に必要です)。
また、成長因子*、ヘパリンまたはECMタンパク質(例えば、フィブロネクチンまたはコラーゲン)などの他の細胞成分をハイドロゲルに加えることもできます。
*成分によってゲル内に留まらない物質がありますので、その場合は培地に添加する必要があります。

3D培養中に細胞を自由に移動させられるクロスリンカー

細胞の移動、走化性や細胞間の相互作用を3Dゲル内で観察したい場合はMMP切断が可能な配列を付属させたクロスリンカーがおすすめです。
ゲル形成後にMMP配列を切断することで、ポリマーの連結を担うクロスリンカーが切断され、細胞が自由に移動することができます。
*すべてのMMPがCDリンクを切断するとは示されていません。 CD-Linkは、Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Alaの配列を含み、少なくともMMP1、MMP3、MMP7およびMMP9によって切断されることが知られています。

クロスリンカーの種類 クロスリンカーの特徴 対応するTrueGel3Dキット
PEG 安定で切断不可能
=培養中に細胞を移動させない(固定する)
TRUE2,5,6,9
CD 細胞由来のMMPで切断可能
=培養中に細胞が自由に移動できる
TRUE1,3,4,7,8

3D培養後に細胞を回収可能なゲル

TrueGel3Dゲル内で3D培養した後に、細胞を回収したい場合はデキストランベースの製品がおすすめです。
デキストランのベースのポリマーで形成したTrueGel3Dゲルは専用の酵素で分解可能です。
PVAベースのポリマーで形成したTrueGel3Dゲルから細胞を取り出すことはできません。

ポリマーの種類 ポリマーの特徴 対応するTrueGel3Dキット
PVA 安定で分解不可能
=ゲルから細胞を回収しない
TRUE4,5,8,9
デキストラン 専用酵素(製品番号TRUEENZ)による分解が可能
=ゲルから細胞を回収できる
TRUE1,2,3,6,7

アプリケーションによるキットのセレクションガイド

用途 TRUE1 TRUE2 TRUE3 TRUE4 TRUE5 TRUE6 TRUE7 TRUE8 TRUE9
スフェロイド(マトリクスと増殖が影響しない場合)          
スフェロイド(マトリクスが増殖に影響する場合)   ✔*     ✔* ✔*     ✔*
細胞移動/浸潤アッセイ*   ✔* ✔*     ✔* ✔*  
腺房および上皮シスト形成* ✔*     ✔* ✔*     ✔*
腫瘍-間質共培養   ✔* ✔*     ✔* ✔*  
基質剛性が細胞生理学や行動に影響を及ぼす場合          
細胞および組織の固定化(培養後に回収する場合)              
細胞および組織の固定化(培養後に回収しない場合)              
細胞相互作用のない物理的な障壁として用いる場合          
マイクロチャネルの使用        
シリンジの充填        
2週間以上の安定した長期培養(細胞の回収を行わない場合)          
細胞の回収してその後、免疫染色などの実験に用いる場合        

*オプションとして別売のTrueGel3D RGD adhesion peptideの添加が必要

各成分の化学的な特長

TrueGel3Dハイドロゲルシステムは、合成された非分解性ポリビニルアルコール(PVA)または酵素分解性デキストランの2種類のポリマーのいずれかを使用します。どちらのポリマーも、速いチオール反応性基または遅いチオール反応性基のいずれかで機能が付与されます。速いチオール反応性基は数分以内にハイドロゲルが形成され、遅いチオール反応性基はそれよりゆっくりハイドロゲルが形成されます。

ポリマー(PVAおよびデキストラン)は不活性で細胞に接着しません。ただし接着ペプチドや細胞外マトリックスなどの生理活性物質と結合することで、細胞とポリマーの接着を可能にし、生理的条件を模倣することができます。

TrueGel3Dのクロスリンカーも2種類あります。PEG非細胞分解性クロスリンカーは各末端にチオール(SH)基を有するポリエチレングリコールで構成されています。CD細胞分解性クロスリンカーはPEG非細胞分解性クロスリンカーに類似していますが、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)による切断部位を持つペプチド配列を含んでいます。CD細胞分解性クロスリンカーおよび細胞接着分子を含むゲルである場合、CDクロスリンカー上のMMP切断部位を切断することで、細胞の拡散と移動が可能になります。

 

チオール基(クロスリンカー上)とチオール反応性基(ポリマー上)の等モル濃度(1.8mmol / Lから開始)で最良なゲル形成が生じます。より高濃度のチオール基とチオール反応性基を用いてより堅いゲルを形成することができます。

反応速度は水素イオン濃度(pH)によって制御されます。より低いpH(酸性環境)では、脱プロトン化チオレートアニオンはチオール反応性基とゆっくりと反応し、ポリマーとクロスリンカー間のネットワーク形成が遅くなります。キット中のバッファー溶液(pH5.5および7.2)を混合して、ゲル化時間の最適化を助けるために中間のpHを生成することができます。どちらのバッファーもpHを容易にモニターするためにフェノールレッドを含んでいます。

 

スフェロイド形成や共培養モデルのような多くのアプリケーションでは、予め最適化されたキット(カタログ番号TRUE1-1KT)をご用意しています。このTRUE1-1KTはRGDペプチド付与済みのデキストランポリマーと、D細胞分解性クロスリンカー、溶解用バッファーおよび水で構成されています。このハイドロゲルはTrueGel3D酵素細胞回収液(カタログ番号TRUEENZ-500UL)を使用して細胞回収を行うことができます。

TrueGel3Dキット セレクトチャート

ゲルの固まる速度は? 3D培養後に細胞を
回収する?
3D培養中に細胞を
自由に移動させる?
   
速い>>
回収する>>
移動させない>
FAST-DEXTRAN, PEG
移動させる>
FAST-DEXTRAN, CD
回収しない>>
移動させる>
FAST-PVA, CD
移動させない>
FAST-PVA, PEG
ゆっくり>>
回収する>>
移動させない>
SLO-DEXTRAN, PEG
移動させる>
SLO-DEXTRAN, CD
回収しない>>
移動させる>
SLO-PVA, CD
移動させない>
SLO-PVA, PEG
中程度>
回収する>
移動させる>
pre-configured kit, CD

製品リスト