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FLAG® システム

FLAGトラブルシューティング

問題 可能性 解決方法
溶出タンパク質の回収率が悪い 低結合 結合ステップでのライゼートまたはタンパク質量を多くしてください。または、一昼夜かけてレジンに結合させてください。
低溶出 次の2つの方法のうち、1つを選んで溶出を改善してください。
・溶出溶液中の3XFLAGの濃度を上げてください。
・溶出バッファー(0.1M Glycine pH3.5)に塩を加えてください。
SDS-PAGEでのサンプルバッファーで溶出した際、複数バンドが存在する 抗FLAGM2抗体サブユニットはSDSまたは還元剤によってゲルから分離される SDSまたは還元試薬をサンプルバッファー中に使わないでください。そしてボイルによって溶出してください。
ゲルから上清を分離した後、SDSを加えてください。更にサンプルはボイルしてSDS-PAGEにロードしてください。
シグナルが見えない タンパク質が発現していない ・FLAG核酸配列がベクターコンストラクト中に入っているか確認してください。もし、配列があれば、最適な発現条件を検討してください。
目的タンパク質がサンプル中にみられない。 ・ ポジティブコントロール(10ng/lane)を常に立ててください。もし、ポジコンが働いていれば、サンプルにはFLAG融合タンパク質が含まれていな いか、検出できないくらいの低濃度しか存在していません。但し、抗FLAGM2アフィニティーゲル(品番:A2220)による免疫沈降では、低濃度の FLAG融合タンパク質しか必要ありません。ポジコンは下記の製品があります。
・Amino-Terminal FLAG-BAP fusion protein (品番:P7582)、・Carboxy-Terminal FLAG-BAP fusion protein (品番:P7457)、・Amino-Terminal Me-FLAG-BAP fusion protein (品番:P5975)
検出試薬が有効でない 実 験がうまくいっているかを確かめるために適切なコントロールで使ってください、ポジティブコントロールとして、FLAG-BAP融合タンパク質を 10ng/laneで使用して下さい。コントロールでもシグナルが見られないのなら、新しく準備した検出試薬と、新しいロットの二次抗体-HRPを使用し て、再び、実験を繰り返してください。
化学発光システムを使った際、十分な露出時間でない もし全くシグナルが出なかったら、もっと長時間露出して下さい。30秒から10分の露出時間を推奨します。
使用したフィルムが不適当 Kodak BioMax Light(品番:Z37349-4)のような化学発光用検出フィルムに変えてください。
膜上に目的タンパク質が存在していない Ponceau S溶液(品番:P7170)を使い、膜上のタンパク質を染色してみて下さい。実験系が機能しているかどうかを確かめる為に、可能であればいつでも、ポジ ティブコントロールを入れてください。予め染色されているタンパク質マーカー(品番:C3437,P1677)を使うと、完全に膜にタンパク質が転写され ているか確認できます。
オーバーブロッキングにより、抗原がブロッキング剤でカバーされてしまう。 も しブロッキング試薬、例えば、カゼイン(品番:C7594)またはゲラチンブロッキングバッファー(品番:G7663)など、高濃度で使ったとしたら、シ グナルのマスキングが起こる可能性があります。希釈範囲を1:1から1:3で行ってください。もし、それでも解決されなければ、3%無脂肪ミルクを含んだ TBSを使用してください。
抗体濃度が最適でない 抗FLAG抗体の最適希釈率はタイトレーションによって決定してください。
高い非特異バックグラウンド 細胞溶解濃度が高すぎる 1レーンにつき、全細胞溶解タンパク質2.5-10μgでは、常によいシグナルが得られる十分な量です。最適なシグナル/ノイズ比をを決定するためには、サンプルアプライ量を少なくするか、段階的に希釈してください。
Monoclonal Anti-FLAG M2抗体濃度が高すぎる M2抗体の濃度を0.1-0.5μg/mLの範囲にしてください。希釈する際は、3%低脂肪ミルクの入ったTBSを使用してください。
二次抗体の交差性のため 二次抗体に関しては、最初は30,000倍に希釈して使用してください。それでも、改善されなければ、もっと希釈が必要か、または、さらに特異性の高い二次抗体を使ってください。
Mnoclonal Anti-FLAG M2 antibodyが自然界にある似たエピトープ反応してしまう ブ ロッキング、バインディング、洗浄のステップの間、温度を37℃に上げてください。交差反応が減少することがあります。M2抗体が、FLAG融合タンパク 質と他のタンパク質との違いを認識するかどうかを確認する為の良い手段として、モックトランスフェクトコントロール(挿入DNAなしでプラスミドをトラン スフェクトしたもの)のライゼートを使用してください。
 

試薬耐性表

試薬 影響 コメント
カオトロピック試薬(尿素、塩酸グアニジンなど) M2抗体を変性させます。 ゲル上のM2抗体を変性させてしまい、FLAG融合タンパク質の結合能を低下させてしまうのでこのタイプの試薬はどんなものも使ってはいけません。尿素ならば1M以下で使用できます。
還元試薬(DTT、DTE、2‐メルカプトエタノールなど) M2抗体のS-S結合も還元してしまう ゲル上のM2抗体のジスルフィド結合を緩め、FLAG融合タンパク質の結合能を壊してしまうので、このタイプの試薬はどんなものも使ってはいけません。
TWEEN20 5%まで レジンに結合する非特異的タンパク質を減少させる 5%までなら使用しても大丈夫でしょう。しかし、それ以上使用してはいけません。
TRITON X-100 5%まで レジンに結合する非特異的タンパク質を減少させる 5%までなら使用しても大丈夫でしょう。しかし、それ以上使用してはいけません。
IGEPAL CA-639 0.1%まで レジンに結合する非特異的タンパク質を減少させる 0.1%までなら使用しても大丈夫でしょう。しかし、それ以上使用してはいけません。
CHAPS 0.1%まで レジンに結合する非特異的タンパク質を減少させる 0.1%までなら使用しても大丈夫でしょう。しかし、それ以上使用してはいけません。
ジギトニン 0.2%まで レジンに結合する非特異的タンパク質を減少させる 0.2%までなら使用しても大丈夫でしょう。しかし、それ以上使用してはいけません。
塩化ナトリウム 1.0Mまで レジンに結合する非特異的タンパク質を減少させる 1.0Mまでなら使用しても大丈夫でしょう。しかし、それ以上使用してはいけません。
ドデシル硫酸ナトリウム  膜転写されたM2抗体を変性させます。 ゲル上のM2抗体を変性させてしまい、FLAG融合タンパク質の結合能を低下させてしまうのでこの界面活性剤を含むどんな試薬も使ってはいけません。免疫沈降実験では、タンパク質除去用にサンプルバッファー中に入れていますが、ゲルは再使用できません。
0.1M グリシンHCl pH3.5 FLAGタンパク質をゲルから溶出します。 カラムにグリシンHClを入れて20分以上放置してはいけません。それ以上放置しておくと、M2抗体を変性させてしまうでしょう。
デオキシコール酸 M2抗体にFLAGタンパク質が結合するのを阻害します。 M2抗体とFLAG融合タンパク質の結合を阻害してしまうので、この界面活性剤を含むどんな試薬も使用してはいけません。

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