ウェスタンブロット

ウェスタンブロッティングの基礎知識

ウェスタンブロット法とは

タンパク質をメンブレンにブロッティングし、それ以降の解析に利用する技術は、1979年にTowbinらによって開発されてから今日まで、タンパク質を扱う研究室にとって日常的かつ不可欠な手法となっています(Towbin et al., 1979)。ウェスタンブロット法では、タンパク質を含む試料をSDS-PAGE後、PVDF製メンブレンなどに電気的に転写します。標的タンパク質は、特異的結合性を持つ抗体などの分子を利用し、特異的に検出されます。

転写条件最適化のすすめ

ウェスタンブロッティングは標的タンパク質の分離、転写、検出(抗原抗体)反応という3つの工程から成る複雑な手法です(図1)。思わしくない結果が得られた場合、最後の工程、つまり検出反応に原因があるのではないかと考えがちです。しかし、抗体濃度の調節がもたらす効果は、最終的に検出されるシグナルとノイズの両方に影響を与えることが多く、シグナル- ノイズ(S/N)比の改善には多くの労力が必要になる場合が見受けられます。

ウェスタンブロッティングのワークフロー

図1 ウェスタンブロッティングのワークフロー

一方、転写条件の最適化はタンパク質の分子サイズに依存して大まかな指標があります。目的タンパク質のサイズを基準に条件の最適化を実施することで、メンブレンに転写されるタンパク質量を増やすことが可能です。転写される標的タンパク質の量の増加は、S/N比の改善に繋がりやすいことが知られています。

転写の工程では、SDS-PAGEゲル中でマイナスに帯電しているタンパク質-SDS分子複合体が電場から力を受け、プラス極側に移動します。ゲルから抜け出したタンパク質は、疎水性相互作用によりメンブレンに吸着します。一般的に、タンパク質が低分子であるほどゲルからもメンブレンからも抜け出しやすく、高分子であるほどゲルからは抜け出しにくくメンブレンに吸着しやすいことが知られています(図2)。

サイズに依存した、転写時のゲルおよびメンブレン上のタンパク質挙動モデル

図2 サイズに依存した、転写時のゲルおよびメンブレン上のタンパク質挙動モデル

メタノール濃度の調節による転写条件の最適化

低分子タンパク質であればメンブレンへの吸着効率を上げる条件、高分子タンパク質であればゲルからの溶出を促進する条件を検討することで、転写効率は向上します。実はこの条件検討は、転写バッファーの組成を調整することで効率的に実施可能です。標準プロトコールでは、 25 mM Tris Base, 192 mM Glycine, 10% Methanol という組成の転写バッファーが推奨されています。

この中で重要なのはメタノール濃度です。メタノールはタンパク質と結合しているSDS に置き換わることで、タンパク質のメンブレンへの吸着を促進します。したがって、低分子タンパク質の場合にはメタノール濃度を高めに、高分子タンパク質の場合にはメタノール濃度を低めに変化させることで転写効率を改善可能です。ただし、メタノールはゲルの膨潤や変形を防ぐ効果も持ち合わせており、極端に低濃度の場合はゲルの膨潤が、過剰な場合はゲルの収縮(変形)が起こりやすくなりますので、ご注意ください。
標的タンパク質と異なる位置のエキストラバンドが強く検出されてしまう場合も、転写条件の最適化がデータの改善につながる可能性が高いです。

Immobilon-PSQで低分子タンパク質の感度アップ

サンプルに含まれる標的タンパク質が微量な場合は、転写条件の最適化だけではS/N比の改善につながらないことが知られています。メンブレンに吸着するタンパク質の量を増やすことが、この場合の改善につながります。
トランスファーメンブレンの内部表面積の大きさは、吸着するタンパク質の量と比例関係にあります。したがって、トランスファーメンブレンの孔径を小さくすることがS/N比の改善つまり、検出感度の上昇改善につながります。たとえば、トランスファーメンブレンとして広く使用されているimmobilon-P(孔径0.45 μm のPVDF膜)ではなく、Immobilon-PSQ(孔径 0.2 μm のPVDF膜)を使うことで、メンブレン上に吸着される総タンパク質の量を増やすことができ、微量タンパク質のS/N 比の改善が期待されます。
Immobilon-PSQはタンパク質シークエンシング用に開発されたメンブレンですが、微量タンパク質の検出、吸着しにくい低分子タンパク質の検出や、検出感度が不十分な事例にもその特性が発揮されます。ただし、孔径の小さいメンブレンでは、抗体を含むタンパク質全般が吸着しやすい傾向があるため、メンブレンの孔径を小さくすることでバックグラウンドシグナルが高くなってしまう場合は、洗浄条件の検討が必要です。

高いバックグラウンドシグナルは高塩濃度バッファーで効果的に洗浄

免疫反応後のトランスファーメンブレンの洗浄法としては、PBSあるいはTBSバッファーにメンブレンを浸し、5分間の振とうを3回以上することが標準的です。高精製度の抗体を用いる場合には上記バッファーで十分に洗浄可能ですが、より広範な使用に耐える洗浄バッファーとしては、PBSあるいはTBSにTriton-X 100あるいはTween-20を0.05%v/v の最終濃度で添加したPBSTやTBSTバッファーが推奨されます。
それだけでは洗いきれないバックグラウンドシグナルの洗浄には、塩の添加が高い効果を発揮します。具体的には、塩化ナトリウム(最大0.5 M)およびSDS(最大0.2%)を添加したPBSあるいはTBSで、二次抗体反応後に30分間振とう洗浄を行うことで、バックグラウンドシグナルを大きく低減させることが可能です(図3)。

塩の添加による洗浄効果

図3 塩の添加による洗浄効果
0.5 M NaCl と0.2% SDSを加えていないPBSおよびPBS-Tによる洗浄(標準法)と、それらを含有するバッファーでの洗浄(高塩濃度バッファーによる洗浄)の比較。高塩濃度バッファーによる洗浄は、とくにタンパク質保持能の高いImmobilon-PSQにおいてバックグラウンドシグナルの低減に効果があることがわかります。



参考文献:

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