細胞アプリケーション

【参考】コラゲナーゼの特徴

目次

> イントロダクション
> 従来型コラゲナーゼとは?
> コラゲナーゼ酵素型
> 従来型コラゲナーゼの限界
> リファレンス

イントロダクション

従来型のコラゲナーゼ製剤は、細菌(Clostridium histolyticum)培養液の上澄から濃縮されています。 この手法で作成される製剤は、構成の変動性が高くロット間差が大きく、エンドトキシンのレベルも高くなってしまいがちです。
コラゲナーゼの活性は、意図して調製されてさえいないのです。実は、多くのコラゲナーゼ メーカーが、特定ロットの生産が終わったのち酵素活性を測定し、その時点で製品名を決定していることさえあるのです。
そういった不確定性の多い中での例外と言えるのが、ロシュの提供するCollagenase Pです。 ロシュの独占的な発酵技術によって、Collagenase Pは従来型コラゲナーゼとして特筆すべきコラーゲン特異的融解活性を与えられています。

従来型コラゲナーゼとは?

従来のコラゲナーゼ製剤は、細菌(Clostridium histolyticum)培養液の上澄から濃縮されています。 この手法で作成される製剤は、30種類におよぶ酵素の他、細胞片・色素・エンドトキシンを含有した不均質な混合体です。 エンドトキシンのレベルと構成の変動性が、従来のコラゲナーゼにおける欠点です。その名前から示唆されるように、主な酵素成分はコラゲナーゼ IおよびIIです(Bond and Van Wart, 1984)。 その他に発見された主要なプロテアーゼには、 neutral protease, clostripain, trypsin, elastase, aminopeptidaseが含まれます。コラゲナーゼ製剤から分離されている非タンパク質分解酵素にはgalactosidase, acetylglucosaminidase, fucosidase, phospholipase, neuraminidase, hyaluronidaseがあります。

コラゲナーゼ酵素型

コラゲナーゼは、コラーゲンをより小さなペプチド断片に切断するmetalloendoproteinaseであり、安定化と活性化のためにCa2+を必要とする亜鉛を含有した酵素です。 それゆえに、二価陽イオン(EDTA, EGTA)のキレート剤が、コラゲナーゼ活性を抑制します。 コラーゲン分解因子を精製するあらゆる試みで、コラゲナーゼ酵素型の不均一性が示されています(表1)。 未精製のコラゲナーゼ試料には、6種類もの亜種が存在します。 これらの結果から、全ての精製コラゲナーゼ分画は、その基質特異性に基づいて特徴づけられています。 Bond と Van Wartによる論文(1984)では、基質特異性に基づいた2クラスの酵素活性が記述されています。 クラス I コラゲナーゼは高分子量のコラーゲンに対して、クラス II コラゲナーゼは低分子量のコラーゲン断片に対して、それぞれ高い活性を示しています。 これらの特徴的な活性は、組織の分散において理想的であり、天然コラーゲンに対して相乗的に作用することが報告されています(Kono, 1968).

 

表 1:クロストリジウム由来コラゲナーゼの不均質性に関する文献

Separation Methods Collagenase Forms Designation Primary Author
DEAE-Cellulose 3 A, B, C Grant, 1959
DEAE-Sephadex 3 I, II, III Mandl, 1964
DEAE-Cellulose 2 I, II Yoshida, 1965
SE-Cellulose
DEAE-Cellulose
3 A-a, B-a, B-b Kono, 1968
DEAE-Cellulose
DEAE-Cellulose
2
2
A, B
A, B
Seifter, 1970
Takahashi, 1972
DEAE-Cellulose
IEF
4 I, II, IIIa, IIIb Lwebuga-Mukasa, 1976
SP Sephadex
DEAE-Cellulose
Sephacryl s-200
2   Oppenheim, 1978
DEAE-Cellulose
IEF
Collagen-Sepharose
3 C1, C2, C3 Sugasawra, 1984
Hydroxyapatite
Sephacryl S-200
L-Arg-Sepharose
Red Dye Ligand
DEAE-Cellulose
SP Sephadex
6 Class I & II Bond, 1984
DEAE-Sephadex A50
Preparative PAGE
2
6
CGN-A, CGN-B, 1 - 6 Hefley, 1987

 

未精製コラゲナーゼ製剤のクロマトグラフィー分画は、コラーゲン分解活性を有する多数の酵素成分を同定するという結果に至っています(Wünsch, 1963)。 コラゲナーゼ分解活性は、ロイシン残基とグリシン残基の間の合成基質であるPZ-Pro-Leu-Gly-Pro-D- Argの酵素的切断により確認されます。 その結果得られる親油性のPZ-Pro-Leu断片は溶媒抽出により分離され、320 nmで吸光度を増加させることにより定量化されています。

従来型コラゲナーゼの限界

従来型コラゲナーゼは、特にハイレベルなアプリケーションにおいて限界を露呈することがあります。

High Endotoxin Levels

従来のコラゲナーゼに含まれる混入物のうち、もっとも甚大な悪影響が懸念されるのが細菌内毒素です。 limulus amebocyte lysateアッセイによると、従来型のコラゲナーゼは作業濃度において13,000 EU/mlもの高いエンドトキシン濃度を示すことがあります(リベラーゼ リサーチグレード酵素の作業濃度におけるエンドトキシンレベルは、平均して10 EU/ml未満)。一般的な細胞分散用酵素のエンドトキシン含有量(Jahr, 1996; Vargas, 1997; Linetsky, 1997; You, 1997)と、単離された細胞の失活との関連性も指摘されています(Vargas, 1998; Eckhardt, 1999; Jahr, 1999)。

Variability of Composition

従来のコラゲナーゼの全体組成は、ロット間および製造業者間で非常にばらつきがあります。 酵素活性と酵素濃度は、菌株・培養条件・培養齢などにより変動します。 ロット間のばらつきは、コラゲナーゼ製剤の特徴であり、時間のかかるロット試験が必要となります。 そのうえ、一度ロットが選択された後も、コラゲナーゼが時間とともに変化(分解)しないという保証はありません。 従来型のコラゲナーゼは保管条件に関わらず、時間とともに組織分散効率が悪くなる傾向が報告されています(Cavanagh, 1997)。

リファレンス

  • Bond MD, Van Wart HE. Purification and separation of individual collagenases of Clostridium histolyticum using red dye ligand chromatography. Biochemistry 1984; 23:3077.
  • Cavanagh TJ, Lakey JRT, Wright MJ, Fetterhoff T, Wile K. Crude collagenase loses islet-isolating efficacy regardless of storage conditions. Transplant. Proc. 1997; 29:1942.
  • Eckhardt T, Jahr H, Federlin K, Bretzel RG. Endotoxin impairs the engraftment of rat islets transplanted beneath the kidney capsule of C57BL/6-mice. J. Mol. Medicine (Berlin) 1999; 77(1):123-125.
  • Grant NH, Alburn HE. Studies on the collagenases of Clostridium histolyticum. Arch. Biochem. & Biophys. 1959; 82:245.
  • Hefley TJ. Utilization of FPLC-purified bacterial collagenase for the isolation of cells from bone. J. Bone Min. Res. 1987; 2:505.
  • Jahr H, Pfeiffer G, Weinand S, Hering BJ, Federlin K, Bretzel RG. Endotoxin-like activity in collagenase and Ficoll. Hormone and Metabolic Research 1996; 28(1):58.
  • Jahr H, Pfeiffer G, Hering BJ, Federlin K, Bretzel RG. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J. Mol. Medicine (Berlin) 1999; 77(1):118-120.
  • Kono T. Purification and partial characterization of collagenolytic enzymes from Clostridium histolyticum.Biochemistry 1968; 7:1106.
  • Linetsky E, Bottino R, Lehmann R, Alejandro R, Inverardi L, Ricordi C. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, Liberase. Diabetes 1997; 46:1120.
  • Lwebuga-Mukasa JS, Harper E, Taylor P. Collagenase enzymes from Clostridium: characterization of individual enzymes. Biochemistry 1976; 15:4736.
  • Mandl I, Keller S, Manahan J. Multiplicity of Clostridium histolyticum collagenases. Biochemistry (Washington) 1964; 3(11):1737.
  • Oppenheim F, Franzblau C. A modified procedure for the purification of clostridial collagenase. Prep. Biochem. 1978; 8:387.
  • Seifter S, Harper E. The Collagenases. Boyer PD, ed. The Enzymes, New York; Academic Press 1970: 3:649.
  • Sugasawara R, Harper E. Purification and characterization of three forms of collagenase from Clostridium histolyticum. Biochemistry 1984; 23:5175.
  • Takahashi S, Siefter S. New culture conditions for Clostridium histolyticum leading to production of collagenase of high specific activity. J. Appl. Bacteriol. 1972; 35:647.
  • Vargas F, Vives-Pi M, Somoza N, Fernandez-Llamazares J, Pujol-Borrell R. Endotoxin activity of collagenase and human islet transplantation (letter). Lancet 1997; 350 (9078): 641.
  • Vargas F, Vives-Pi M, Somoza N, Armengol P, Alcade L, Marti M, Costa M, Serradell L, Dominguez O, Fernandez-Llamazares J, Julian JF, Sanmarti A, Pujol-Borrell R. Endotoxin contamination may be responsible for the unexplained failure of human pancreatic islet transplantation. Transplantation, 1998; 65(5):722-727.
  • Wünsch E, Heidrich HC. Zur quantitativen Bestimmung der Kollagenase. Z. Physiol. Chem. 1963; 333:149.
  • Yoshida E, Noda H. Isolation and characterization of collagenases I and II from Clostridium histolyticum. Biochem. Biophys. Acta 1965; 105:562-574.
  • You MS, Parlesak A, Viebahn R, Bode C. Endotoxin contamination in collagenase-isolated hepatocytes can be avoided by EDTA preparation. J. Hepatology 1997; 26 (suppl. 1):266.
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