細胞アプリケーション

FAQ & トラブルシューティング(細胞アプリケーション)

悩みが解決!ロシュ製品でお困りの内容や一般的なご質問に対する回答は下記をクリックしてご覧ください。

一般的な質問

一般的な質問

BCL-2タンパク質の分析によるアポトーシスのステージは初期、中期、後期?

アポトーシスの初期です。哺乳類システムにおいて、BCL-プロトオンコジーンはアポトーシスの誘導をブロックします。

アポトーシスとネクローシスの分別はどのようにしたらできますか?

単一細胞レベルでのアポトーシスの検出や定量、ネクローシスとの分別には、アネキシンV標識に基づいたAnnexin-V-FLUOS Staining Kitの使用を推奨します。

細胞質タンパク質分布のBAX:BCL-2の比率をどうすればウェスタンブロットで測定できますか?

  • ウェスタンブロットで見てタンパク質の比率を得るために、一つはイメージングデバイスが使用できます。タンパク質のバンドの強度と幅に基づくタンパク質の定量です。
  • 他のアプローチはゲルのクマシーブルー染色です。バンド強度と幅を観察することで比率を測定でき、主観的に比率を割り当てます。リファレンス:テクニックについては、Nature, Oncogene 2002, 21, 3727-3238の図10をご覧ください。

M30は初期のアポトーシスのみを検出しますか? サイトケラチン18に何が起こっていますか?

M30 CytoDEATHはTUNELよりも初期のアポトーシスを検出します。M30により検出されるCK18の切断部位は、後期のアポトーシスではさらに切断されます。それゆえ、TUNELと比べて、M30は非常に後期のアポトーシスは検出しません。アポトーシス細胞の集積(TUNELでの検出のような)ではなく、細胞集団のアポトーシスインデックスを測定します。M30染色のシグナル強度は通常、TUNELよりもかなり低いものです。

TUNEL法での検出には蛍光顕微鏡が必要ですか?

In Situ Cell Death Detection Kit AP とIn Situ Cell Death Detection Kit PODは、光学顕微鏡で検出できる発色物を生じます。
In Situ Cell Death Detection Kit, FluoresceinIn Situ Cell Death Detection Kit TMR redは検出には、蛍光顕微鏡やフローサイトメーターが必要です。

TUNEL操作法の中で最も実際に重要なステップは?

固定が最も重要なステップです。概して、アポトーシス細胞の断片化したDNAが、操作中に洗い流されない(擬陰性の原因)ように、パラフォルムアルデヒドやフォルマリンのような架橋型の固定液を推奨します。

凍結保存されたラット脳でのTUNEL法の文献はありますか?

こちらをご参照ください。
Neuroscience Vol.102, No.3, p 503-513, 2001 "Role of exitatory amino acid transporter 1?in neonatal rat neuronal damage induced by hypoxia-ischemia".

TUNEL法でプラスチック包埋組織切片は使用できますか?

いいえ。組織の包埋に使用されるプラスチックの重合には、しばしばUVライトが使用されます。UVライトはDNAの切断を引き起こし、ターミナルトランスフェラーゼがこの切断物を標識するため、擬陽性の結果となります。それゆえ、TUNEL法で分析するサンプルには、DNA切断を引き起こす包埋操作は推奨できません(In Situ Cell Death Detection Kitsの一つを使用する場合)。

アポトーシスはどうやったら誘導できますか?

ロシュ社では以下の製品を提供しています。
TNF-alpha, human, rec E.coli
TNF-alpha, human, rec yeast
TNF-alpha, mouse, rec E.coli
Staurosporine(プロテインキナーゼ インヒビター)
 
アポトーシスは以下の物質でも誘導できます。
UV, Actinomycin D (C1), Camptothecin, Cycloheximide, Dexamethasone, Ceramid, Etoposide, Vitamin D3, Glucocorticoidなど

ラットの中枢神経系での細胞増殖を見るために、何度、BrdUで動物を処理すべきか知りたいのです。BrdUを腹腔内注射したとき、BrdUの分解はどうでしょうか? 取り込みまでにどの程度長くかかるのでしょう?

特異的な科学的問題にマッチするプロトコールの詳細は、それぞれの科学論文を参照してください。
5-Bromo-2'-deoxy-uridine Labeling and Detection Kit IIIn Situ Cell Proliferation Kit, FLUOSの製品マニュアルにおけるin vivo標識の一般的なプロトコールは、
(1) BrdU標識試薬(ボトル1)の原液を注射します。100 gの体重当り、1 mLがほとんどのアプリケーションで適します。BrdU標識試薬は腹腔内注射を推奨します。
(2) 注射の1-4時間後に、動物を殺し、調べたい器官を除去します。
(3) 凍結切片あるいはパラフィン包埋切片用に組織を処理します。

キット・製品の使い方の質問

細胞増殖測定・BrdU

細胞増殖ELISA、BrdUを使用するとき、刺激デックスを計算するための特定の計算式とは何ですか? 刺激と未刺激は顕著に異なることを示すための、意味のある値は何ですか?

刺激インデックスを計算するためには、最初に二重測定/三重測定の平均値を計算し、各サンプルとコントロールの(細胞の無い)バックグランド値を差し引きます。次にサンプルの値(刺激細胞)を陰性コントロール(無刺激細胞)で割り算します。これは様々な試験の間で比較できる相対値(無単位)を導きます。顕著な刺激の定義に関しては、それは細胞のタイプや刺激物質、他の影響を与えるファクターに強く依存しますので、各実験セットアップへの研究者の経験にしたがって決定すべきです。

In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOSを使用して、接着細胞でBrdUの取り込みをフローサイトメトリーにより測定したいと思います。トリプシン処理と固定化溶液IVでの固定の後、FACS分析の前に固定細胞を4℃か-20℃で数日間保存できますか?

プロトコールの中断はお勧めできません。

停止溶液を加えた場合と加えない場合の、Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) の吸光度測定の違いは何ですか?

停止溶液を加えない場合は370/492 nmで測定し、時間を延長して発色を測定できるので至適な実験条件を決定します。反応停止液を加えた場合は450/690 nmで測定し、実験で指定の時間が過ぎても正確な値が、より簡便に測定できます。

BrdU Labeling Detection Kit 1を購入しました。これは、BrdUと他の抗体(FLAG抗体)での二重染色で使用できますか?  もし可能なら、最初にどちらで染色するべきでしょうか?

二重標識:二重染色には、固定化ステップまでキットのプロトコールを行い、次に別のパラメーターを検出するための抗体を加えてください。洗浄後、Anti-BrdUをキットのプロトコールどおりに加え、次に二次抗体を添加します。これは原理的に1ステップでも行えます。Anti-BrdUと他の抗体を検出する二次抗体を混ぜる場合は、その他のパラメーターを検出する一次抗体は、マウス由来ではないことに注意してください。

私はCell Proliferation Kit I, MTTを使用しています。MTTによる4時間のインキュベーションステップの後、細胞を溶解する前にMTTと培地を除去する必要はありますか?

細胞を溶解する前にMTTと培地を除去する必要はありません。MTTと培地を含むウェルに100 μLの可溶化溶液を加えるだけです。

細胞増殖試薬WST-1

細胞増殖試薬WST-1で吸光度を測定する前に、細胞がウェル底に落ち着くのを待つ必要はありますか?

細胞は測定に影響しませんので、ウェルの底に落ち着くのを待つ必要はありません。WST-1分解の定量をするための波長では、細胞は吸収を持ちません。それゆえ、更なるステップは必要とせず、振とうの後すぐに、あるいはプロトコールに従い測定できます。

WST-1アッセイにフェノールレッドやFCSは影響しますか? この2種類の試薬の許容できる範囲(FCS濃度の上限、フェノールレッドの添加量)は?

フェノールレッドは、吸光度で最大0.1 ODユニット増加させますが、陰性コントロールでこの値は差し引かれます。10%までのFCSの添加は問題ありません。フェノールレッドとFCSの許容範囲は試験していませんが、より高いFCSでも問題は起こらないはずです。全般的に、陰性コントロールは、サンプルと同様に処理してください。

WST-1反応を停止することは出来ますか?

はい。サンプルを凍結させるか、1% Triton X-100/ 0.1% SDS(終濃度)を室温で5分間加えることで、反応を停止することが出来ます。

WST-1による細胞の処理は、細胞生存活性に悪影響がありますか?

我々の経験によると、Cell Proliferation Reagent WST-1で処理された細胞は、処理後も少なくとも2日は生存しています。処理細胞が継代あるいは長時間培養できるかどうかはわかりません。しかしながら、培養細胞の生存活性のインプロセスコントロールとして、WST-1を使用しているお客様からのレポートを受け取っています。細胞を染色、その後に色素を洗浄の後、培養と実験を通常通り行っています。このことは、WST-1は培養細胞において、長期間の悪影響を示さないことを示しています。

なぜ、細胞増殖試薬WST-1のプロトコールの、2.4の細胞障害性アッセイ(TNFα)の培地にアクチノマイシンDの添加が必要で、2.3の細胞増殖アッセイでは必要ないのでしょうか?

アクチノマイシンはTNFαと共同で細胞障害性を誘導します。以下の論文(Reference)の例と比較してください。
J Vet Med Sci. 1998 Oct;60(10):1087-91.Related Articles
In vitro cytotoxicity of recombinant human-TNF-alpha and actinomycin D on canine normal and tumor cells.
Aoki M, Kuwamura M, Kotani T, Katamoto H, Kubo K, Nomura K, Sasaki N, Ohashi F.
Department of Veterinary Surgery, School of Agriculture, Osaka Prefecture University, Japan
イヌの正常および腫瘍細胞でのリコンビナントヒトTNFαとアクチノマイシンDのin vitro細胞障害性が評価されました。rh-TNFαは培養イヌ腎臓カルシノーマ細胞(CKCa-1)で、量依存的に細胞障害性と細胞増殖阻害効果を示しました。TNFα単独では、イヌ正常細胞ではわずかな細胞障害性しか生み出しませんが、ACT Dとの組み合わせで、腎臓、骨髄、脾臓、心筋、肺由来のイヌ正常細胞において、中程度の細胞障害性を示しました。自発的な腫瘍細胞での効果を実験したとき、rh-TNFαとACT-Dの組み合わせは、腫瘍細胞の60%で相当な細胞障害効果を示しました。試験されたすべての哺乳類の混合腫瘍と腺腫瘍はこの組み合わせに感受性を持っていました。このデータは、rh-TNFαとACT-Dの組み合わせが、ある種のイヌ腫瘍細胞においてin vitroで細胞障害性を持つことを示しています。

細胞障害性検出

細胞障害性検出キット(LDH)を使用しています。マニュアルでのインキュベーション時間には2-24時間と推奨されていますが、私のアッセイ(細胞増殖アッセイ)では、細胞を1週間インキュベーションします。この長時間では、培養細胞中のLDHは分解しますか? 何か推奨する点は?

LDHは室温で1週間、2-8℃で3週間安定と報告されています。凍結は避けます。プロトコールには、真核細胞培養中の細胞死を測定するために、5日以上たってからLDHを測定した例が記載されています。同様の実験セットアップがあなたのアプリケーションにも適しているでしょう。もし、本当に時間を過ぎてのLDHの完全放出量を測定したいなら、既知量のLDHと培地をインキュベートし、活性の低下を測定します。しかしながら、実験中の"本当の濃度"の計算は、培地への連続的なLDHの放出のために、非常に面倒です。それゆえ、LDHの存在は常に、その時間での様々な"安定性のレベル"の混合として表されます。

Cytotoxicity Detection Kit のためのLDHスタンダードカーブの作成法は?

以下のプロトコールが使用できます。
- 200 μL LDH溶液(アッセイ培地中2 U/mL)をウェルに加えます
- この溶液100μLを次のウェルに移します
- 100μLのアッセイ培地を加えます
- ミックスします
- ステップ2から再開します
- 14個のウェルを調製した後(濃度レンジは1.0 U/mLから0.0001 U/mL)100 μLの反応ミックスを加えます
- ミックスします
- 室温で30分間インキュベーションした後、測定します

Cytotoxicity Detection Kit (LDH) の使用説明書では、キットを96ウェルマイクロプレートで使用するようにと記載されていますが、より少ないウェルフォーマットでも使用できますか?

Cytotoxicity Detection Kit (LDH)キットは96ウェルマイクロプレートでの使用に至適化されています。他のプレートフォーマットで使用したことはありませんので、その場合の条件と操作法は実験的に決定しなければなりません。一般的な推奨として、すべての試薬をキットと同じ比率で、スケールダウン/アップします。

細胞死検出

細胞検出ELISA PLUSを使用してアポトーシス細胞の数が測定できますか?

いいえ。ELISAデータは、未誘導のコントロール群と比較した、アポトーシス郡中の細胞死レベルの変化として評価されます。個別の細胞でのデータは提供しません。

カスパーゼアッセイを通じてアポトーシスを測定したいとき、陽性コントロールを得るために細胞をどのように処理すべきでしょうか?

アポトーシスを誘導するための一般的な方法は、細胞をカンプトテシンで処理することです。濃度は、細胞のタイプや細胞濃度に応じて変動します。典型的な結果は、Apoptosis and Cell Proliferation Manual, 2nd edition の19-23ページに見られます。

In Situ Cell Death Detection Kit, PODはヒツジの組織で使用できますか(ヒツジ由来の抗フルオレセイン抗体が含まれていますが)?

はい、この製品はヒツジ組織で使用できます。抗体は特異的にフルオレセインを検出します。抗体がヒツジで作られたということを考慮する意味はありません。

細胞死検出ELISA中の溶解バッファーで溶解したライセート中のタンパク質量を測定することは可能ですか?

溶解バッファーはタンパク質と界面活性剤を含んでいますので、溶解サンプル中のタンパク質定量は出来ません。

In Situ Cell Death Detection Kit, Fluoresceinを使用していますが、標識試薬は数回の凍結融解を繰り返すことは可能ですか? 1度に2個のサンプルしか使用しないので、試薬を無駄にしたくは無いのです。

凍結融解を繰り返すことは避けてください。我々は、使用量に応じて、小分けしての保存をお勧めします。
TUNEL反応ミックスはまったく保存できないことに留意してください。使用前に新たに調製します。使用時まで、TUNEL反応ミックスは氷上に静置してください。

何故、In Situ Cell Death Detection Kitsには基質が含まれないのですか?

これらのキットはホスファターゼやペルオキシダーゼの一般的な、多くの基質と共に使われます。多くの研究室ではすでにそれら基質を持っており、彼らのシステムで基質がどのように作動するかというノウハウを持っていますので、基質をキットに入れないことを決定しました。これらのキットは二次染色のための柔軟性を提供します。

様々な細胞株でIn Situ Cell Death Detection Kit, PODを使用したいと思います。各細胞株で陽性コントロールと陰性コントロールを立てる必要がありますか?

原理的に、すべての実験で1回陽性コントロールを行う必要があります(各細胞株ではなく)。このコントロールは実験操作がうまく機能しているかを保証するためのものです。
それに対して、陰性コントロールは、アッセイで使用するすべての細胞株で行うべきです。

Cell Death Detection ELISAPLUSは、in vitroで増殖している細胞での使用を推奨できますか?

Cell Death Detection ELISAPLUSは、細胞の前標識を必要としませんので、in vitroでは増殖しない(分離された新鮮な腫瘍細胞など)細胞中の、アポトーシス間のゲノムDNAのヌクレオソーム内での分解も検出できます。このキットを、アポトーシスを誘導した後の細胞の細胞質中(細胞の溶解が必要)および、血清/血漿や培養上澄中のネクローシス細胞から遊離されたヒストン複合DNAフラグメント(モノおよびオリゴヌクレオソーム)の相対定量に使用します。増殖細胞中のアポトーシスあるいはネクローシスの検出に興味があるなら、Cellular DNA Fragmentation ELISAが推奨されます。Cellular DNA Fragmentation ELISAは、フラグメンテーションおよびBrdU標識DNAの定量により、アポトーシス、ネクローシス、細胞障害性を測定します。BrdUでのDNAの標識は増幅(複製)時にのみ可能です。このキットはDNAフラグメントを検出します。
・アポトーシス細胞の細胞質中において、[3H]-チミジンに基づくDNAフラグメンテーションアッセイのNon-RIの代替品として供給されます。
・ネクローシスや細胞障害性の間に、損傷を受けた標的細胞による細胞培養上澄中への遊離において、[3H]-チミジンおよび[51Cr]-リリースアッセイのNon-RIの代替品として供給されます。細胞死のタイプの判別は上澄と細胞溶解液中のDNAフラグメント濃度の比較とカイネティックス分析を行うことにより、可能となります。

Cell Death Detection ELISAPLUSを使用しています。細胞アッセイのプロトコール中で、マイクロプレートの遠心ステップが記述されています。 アポトーシスの検出で上澄を使用する前の、200 x gの遠心はなぜ必要ですか? 培養上澄中の断片化したDNAのサイズ幅は200 x g の遠心で大丈夫ですか? この遠心操作は、接着細胞で行うときも必要ですか?

遠心は、(細胞壁、細胞核、フラグメント化していないDNAを含む)他の細胞成分からDNA断片を分離するために必要です。未処理のDNAは遠心それ自体では分離できませんが、小さなDNA断片(ラダー)は、細胞核壁を通過し、核から抜け出すという事実があります。それゆえ、上澄は大きすぎて核壁を通過できない大きさまでのDNAのすべての スペクトラムを含んでいます。長さの分布は細胞のタイプや誘導剤に依存しています。遠心操作は、浮遊細胞のみに必要です。接着細胞で行うときには、単に上澄を注意深く完全に除去し、その後に細胞をマイクロプレートウェル内で直接溶解します。

Cell Death Detection ELISAPLUSを使用していますが、490 nmのリファレンス波長を用いる目的は何ですか? ABTS-PODシステムからの緑色の産物は405 nmで測るのは知っています。490 nmの吸光度はデータにどのような影響を与えるのですか?

ABTSの酸化物(ラジカル)は確かに405 nmの最大吸光を持っています。492 nmのリファレンス波長を測定するのは、マイクロタイタープレートの不具合や溶液中の固形物によるライトスキャッタリングの異常から生じるバックグランドを補正するために行います。

Cell Death Detection ELISAPLUSを使用する前にU937細胞にアポトーシスを誘導するためにカンプトテシン (Sigma;製品番号 C9911)を使用しています。固体の製品を溶解するにはどうしたらいいでしょう?

培養細胞にアポトーシスを誘導するための、カンプトテシンの使用に関する典型的なプロトコールは以下の通りです。
・DMSO中でカンプトテシンの1 mMストック溶液を調製します。
・4-6 mM(終濃度)のカンプトテシンを細胞懸濁液に加えます(組織培養培地中に5 x 105細胞/mL)。
・至適な結果を得るために、タイムコースを取ります。37℃で2-12時間が推奨されます。
・アポトーシスの誘導を評価するためにデザインされたアッセイを行います。
他の研究者の経験によると、彼らはカンプトテシンをDMSO中に1 mg/mLで溶解し、培養細胞に加える前にPBSや培養液で更に希釈します。典型的な実験例では、カンプトテシンを2μg/mLの終濃度に希釈し、細胞を37℃で2時間処理します。アプリケーションにおける至適条件は実験的に決めなければなりません。
カンプトテシンの別のサプライヤーによると、カンプトテシンは0.24N NaOHを加えたPBSに1 mg/mLで溶解可能とのことです。溶液はフィルター滅菌しなければなりません。以下に有用なリファレンスを紹介します。
Hsiang, Y.H., et al. "Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase I." J Biol Chem. 260: 14873-14878 (1985).
Pantazis. P., et al. "Efficacy of camptothecin congeners in the treatment of human breast carcinoma xenografts."Oncol Res. 5: 273-281 (1993). Thomas, C.J., et al. "Camptothecin: current perspectives." Bioorg Med Chem. 12: 1585-1604 (2004). Shao, R.G., et al. "Activation of PKCalpha downstream from caspases during apoptosis induced by 7-hydroxystaurosporine or the topoisomerase inhibitors, camptothecin and etoposide, in human myeloid leukemia HL60 cells." J Biol Chem. 272: 31321-31325 (1997).

肝臓組織のフォルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)切片を染色するために、In Situ Cell Death Detection Kit, PODを使用しています。二重染色プロトコール(DAKOのEnvision AP/HRP二重染色キット)により切片中の他の抗原を染色したいと思います。この方法を行う際の最適な条件は何でしょう?

最初にFFPE組織スライドでTUNEL反応を行うことをお勧めします。次にスライドを洗浄し、PBS中でTUNELによるアッセイを行います。次に免疫組織化学的アッセイを行います。この二重染色キットもPOD標識二次抗体を使用しているので、最初にIn Situ Cell Death Detection KitのPOD標識Anti-Fluoresceinを不活化しなければなりません。これはスライドを2% H2O2で処理(その後PBSで洗浄)することで行えます。In Situ Cell Death Detection Kit内の基質は褐色沈殿を生じますので、POD標識免疫組織化学抗体の染色には異なる発色源(AECなどの赤)を使用しなければなりません。

In Situ Cell Death Detection Kit, Fluoresceinのプロトコール中でクリオスタット切片の前処理として、"組織切片を固定化溶液で、室温20分間で切片を固定化する。PBSで30分間洗浄する。注:保存のためには無水エタノールで2分間、固定化切片を脱水し、-15~-25℃で保存する。"とありますが、この保存した組織スライドでその後、どのように進めればいいのでしょうか? 浸透化溶液に直接漬けるべきか、それとも最初にPBS中で親水化すべきでしょうか?

どちらも可能です。このプロトコールの次のステップにすぐに行きたいのなら、浸透化溶液中で2分間インキュベートしてください。組織が完全に融解してから2分間のインキュベーションを行います。

細胞死検出ELISA Cell Death Detection ELISAとCell Death Detection ELISA PLUSは、取り換えて使用することが出来ますか? これらの2種類のキットで得られた結果は比較できますか? 変動は使用したキットのタイプというより実験によって起こると考えられますか?

この質問への答えは、可能性としては"はい"です。直接試験したわけではありませんが、両方のキットは同じケミストリーと検出原理を適用しているので取り換えて使用可能です。2種類のキットの差は、Cell Death Detection ELISAPLUSはビオチン標識Anti-ヒストンが結合するストレプトアビジンコートMTPを使用していることです。このステップは、Cell Death Detection ELISAで必要な未処理のMTPへのAnti-ヒストンの結合させることよりも、もっと迅速です。これ以外は、抗体のタイプや基質は同一です。両キットの検出限界はほぼ同じで、Cell Death Detection ELISAで500細胞/ウェル、Cell Death Detection ELISAPLUSで625細胞/ウェルです。このわずかな差は品質管理で使用される細胞の差より起こっています(Cell Death Detection ELISAではHL60、Cell Death Detection ELISAPLUSではU937)。しかし、これらの差異は結果には影響しません。なぜなら、アポトーシス細胞の絶対数を測定しているのではなく、未処理コントロールサンプルと比較した相対定量を行っているからです。

天然のサイトケラチン18はM30 CytoDEATHで検出できますか?

いいえ、M30抗体はヒトサイトケラチン18内のカスパーゼ特異的切断部位を認識し、正常細胞の天然サイトケラチン18は検出できません。

TUNEL法

TUNELアッセイでのPIによるDNAのカウンター染色は可能ですか?

フルオレセインの蛍光がカバー/消光するために、二重染色は不可能です。カウンター染色は、順次的にしか行えません(最初にアポトーシス細胞を決定してから、次にヨードプロピディウムで染色)。あるいは、以下を試してください。
- DNAの染色に0.5 μL/mL PIを使用
- PIの代わりにTO-PRO-3(Molecular Probes社)を適用する

In Situ Cell Death Detection Kits (TUNEL) は凍結切片でも使用できますか? どの種のサンプルが使用できますか?

In Situ Cell Death Detection Kits (TUNEL) はサイトスピン、細胞スメア調製品、スライドで増殖させた接着細胞、凍結切片、パラフィン包埋組織切片で使用できます。

TUNELキットでは特別な洗浄/停止バッファーを必要としますか?

我々の操作法では、特別なバッファーは必要としません。洗浄バッファーはごく一般的に使われるPBSです。使用説明書をご覧ください。

TUNELアッセイでの陽性コントロールに使用するDNase I, Grade Iの、推奨されるバッファーと反応条件は何ですか?

TUNELアッセイには、50 mM Tris-HCl、pH 7.5、1 mg/mL BSA中にDNaseを溶解してください。終濃度は、使用するサンプルに依存します。一般的には、低濃度(1 U/mLで室温、10分間)から開始します。このプロトコールはIn Situ Cell Death Detection Kitの使用説明書にも記載されています。
陽性コントロールが強い陽性に見えない場合は、キットのトラブルシューティングを参照してください。

どういったサンプルのタイプがTUNEL法に使用できますか?

以下のサンプルが使用できます。
-凍結切片-パラフィン包埋切片
-細胞懸濁液
-接着細胞
-細胞スピン調製品
-細胞スメア調製品

TUNEL法で最も良い固定法は?

一般的にTUNELアッセイ(例えば、 In Situ Cell Death Detection Kitsのひとつを使用するとき)には、アッセイ操作の間にアポトーシス細胞のフラグメント化したDNAが洗い流される(これにより擬陰性が生じる)のを避けるために、パラフォルムアルデヒドなどの架橋による固定剤が推奨されます。しかしながら、文献中では細胞成分を架橋しないアセトンやメタノールをベースとした固定液を使用しているものもあります。このような固定液を使用する際に気をつけなければいけないのは、フラグメントDNAが失われることによるアポトーシスの過小評価です。フォルマリンフリーのAccustain™ (Sigma) による培養細胞の固定は、用時調製されたパラフォルムアルデヒドと同様に良好ですが、より迅速です(パラフォルムアルデヒドの60分に対して15分)。ただし、組織で試したことはありません。あるいは、2% グルタルアルデヒドによる固定も良好に作動します。
4% パラフォルムアルデヒドの調製法
スクリューキャップボトル中で、2 g PFA, 40 mL PBS、100 μL 5 N NaOHを混合し、PFAが完全に溶解するまで時々振とうしながらウォーターバス中、56℃でインキュベートします。5 N HCl(約100 μL)でpHを7.4にし、PBSで50 mLまでメスアップします。常に新鮮な溶液を調製してください。調製後はすぐに使用し、残りは廃棄します。

ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TUNEL Enzyme)は二本鎖DNA切断に特異的ですか、それとも一本鎖切断にも反応しますか?

TUNEL法は二本鎖と一本鎖切断共に検出します。

アネキシンV

アネキシン-V-Fluos染色キットはラット細胞株で試験されていますか?

キットはヒトとマウスの細胞株でテストされていますが、ラットではテストされていません。

蛍光顕微鏡での分析の前に、カバースライド上で増殖させた細胞をアネキシン-V-FLUOS染色キットで染色した後、カバースライドを洗浄する必要がありますか?

分析の前に、カバースライドを洗浄する必要はありません。もし望むなら、PBSで洗浄することも出来ます。

試薬が本当に機能しているかどうかをチェックするために、アネキシン-Vアッセイの陽性コントロールはどのように作成すればいいのでしょうか? また、アポトーシスの陽性コントロールはどのように作成できますか?

PBS中の0.01% Triton X-100での短時間の処理により浸透化した細胞がAnnexin-Vの陽性コントロールとして使用できます。 アネキシン-Vは膜の細胞質側に局在する(ネクローシス細胞のように)ホスファチジルセリンに結合することにより、これらの細胞を染色します。アポトーシスの陽性コントロールは、37℃で4時間、1-5 μg/mLのcamptothecin(トポイソメラーゼIインヒビター)で細胞を処理します。細胞密度は5x105 cells/mLにします。

アネキシンV-FLUOS標識溶液を保存し、後で使用することは可能ですか?

いいえ、Annexin-V-FLUOS Staining Kitを使用するときは、それぞれ新規のアッセイに対して標識溶液は用時調製しなければなりません。標識溶液は保存できません。

アネキシンV-ビオチンはマイクロタイタープレートでのアプリケーションに使用できますか?

いいえ、マイクロタイタープレートでのアネキシンV-ビオチンの使用は、高バックグランドとプレートへの非特異的結合の結果をもたらします。アネキシンV-ビオチンの細胞への染色はCa2+イオンに強く依存します。それゆえ、マイクロタイタープレートへのアネキシンV-ビオチンの非特異的な結合は、細胞がより吸着するような製造社のプレートの前処理(コーティングやチャージ)からの結果であると結論付けられます。

アネキシンVはウェスタンブロッティングで使用できますか?

いいえ、アネキシンVはアポトーシス関連タンパク質を認識しません。ホスファチジルセリン(PS)の細胞膜の内側から外側への転座という、アポトーシス細胞での膜の変化を検出します。

アネキシンVの陽性コントロールとして何を使用しますか?

PBS中、0.01%のTriton X-100で浸透化した細胞がアネキシンV機能の陽性コントロールとして使用できます。アネキシンVは(ネクローシス細胞のように)膜の細胞質側に局在するPSに結合することにより、細胞を染色します。

アネキシン-V-Fluosで染色後のサンプルの保存について、反応後にサンプルを保存して、後で観察する方法は?

細胞を染色後に直ちに処置できないなら、4℃(暗所)で1時間は保存できます。これより長い時間は経験がありません。

アネキシンV-FLUOSで染色された細胞の実験例はありますか?

アネキシンV-FLUOSで染色された陽性細胞の例は、Apoptosis and Cell Proliferation Manual, 2nd editionに記載されています。

テロメラーゼ検出

TeloTAGGGテロメラーゼPCR ELISAは他の種のテロメラーゼ活性を検出するのに適していますか?

TeloTAGGGテロメラーゼPCR ELISAが人間以外の種に適しているかどうかは、その種のテロメアリピートシークェンスに依存します。それが人間のようにTTAGGGならそれは可能でしょう。もし他のシークェンスなら、プライマーに問題があり、他のプライマーを使用する必要があります(テロメラーゼがプライマーを認識できず、増幅とハイブリダイゼーションが問題となります)。TTAGGGは最も一般的なテロメアリピートで、動物からカビまでの生物で見つかっています。

TeloTAGGGテロメラーゼPCR ELISAにおいて、ハイブリダイゼーション反応とその後のインキュベーションステップを、振とうをせずに行うことは可能ですか?

インキュベーションを振とうせずに行った場合、シグナルが非常に低く出ます。それゆえ、我々のプロトコールに従うことを強く推奨します。

テロメラーゼ活性を定量するために、 TeloTAGGGテロメラーゼ が使用できますか?

TeloTAGGGテロメラーゼ PCR ELISAはテロメラーゼ活性の高感度定量のためにデザインされています。絶対的な読み取り値は、PCRや基質の反応時間、基質温度などの様々なファクターに依存するため、実験間で変動します。異なる実験で得られたシグナルは、両方の実験でリファレンスサンプルを使用し、このサンプルの読み取り値で結果を較正した場合にのみ、比較できます。

マイコプラズマ検出

マイコプラズマPCR ELISAキットは、操作の途中で停止できますか?

はい。
-PCR反応後、PCR産物を含む反応チューブは4℃でオーバーナイト、-20℃で数週間保存できます。
-PCR産物とキャプチャーオリゴとのハイブリダイゼーションの後は、操作を停止でき、反応チューブは4℃で保存できます。

マイコプラズマPCR ELISAで、キャリーオーバーを防ぐために、Uracil-DNA Glycosylaseは使用できますか?

はい、しかし陽性コントロール反応でUNGを使用しないように気をつけてください。陽性コントロールDNAはdUTPを含むPCR産物で、UNGはそれを破壊します。陽性コントロールはこの方法で作られているので、サンプル反応や他の増幅実験において陽性コントロールのコンタミは起こりません。

マイコプラズマ検出キットはMycoplasma salivariumも検出できますか?

我々には経験はありません。試験しているマイコプラズマはプロトコールに記載のものだけです。

マイコプラズマPCR ELISAでのコントロールサンプルの、405 nmでの測定値はどれくらいですか?

陽性コントロール:1.2 ODかそれ以上。陽性コントロールの値が1.2 OD以下の場合、実験をやり直します。
陰性コントロール:0-0.25 OD。陰性コントロールの値が0.25 OD以上の場合、実験をやり直します。

マイコプラズマPCR ELISAキットはマイコプラズマの生死を測定できますか?

いいえ、出来ません。しかしながら、死んだマイコプラズマは分解を導く溶解が起こります。それゆえ、インタクトなDNAを持つマイコプラズマのみが検出されるはずです。Product information

酵素

凍結乾燥タイプのプロティナーゼKをどのように再懸濁すべきでしょうか?

Proteinase K, recombinant, PCR grade (Lyophilizate)は、1 mg/mLの濃度で保存バッファー:50 mM Tris, 1-5 mM calcium acetate; pH 7.5-8.0に溶解し、保存します。濃度の可能な範囲は1-10 mg/mLです。10 mg/mL以上にしてはいけません。これ以上の濃度では、タンパク質が凝集しやすくなります。高濃度で溶解するときは、37℃まで溶液を暖めます。溶液は4℃で少なくとも12ヶ月は安定です。
あるいは、凍結乾燥品を反応バッファー:10 mM Tris, pH 7.5 / 1mM EDTAに溶解します。

ブレンザイムを溶解した後、どのように保存すべきでしょうか? 保存し、後で使用したい場合、ブレンザイムを溶解する溶液は何が最適でしょうか?

ブレンザイム1-4は注射品質の滅菌水や細胞分散用バッファーで溶解してください。スタンダードな操作法はリベラーゼ酵素を、標準的な組成(無水CaCl2 0.14 g/L; MgCl2・6 H20 0.10 g/L)でMg2+ と Ca2+ を含む、Hanksバッファードサリーンに希釈することです。少量のCa2+はコラゲナーゼの安定性の保持に必要ですが、至適量は分かっていません。亜鉛の添加は必要ありません。EDTAはCa2+をキレートするため、酵素液の成分として、決して使用してはいけません。リベラーゼ酵素溶液へのBSAや他のタンパク質の使用は推奨しません。これらはリベラーゼ中の中性プロテアーゼの競合的基質となるからです。

トランスフェクション

X-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬がOpti-MEM中で希釈された後、室温でどれ位の時間、安定であるかテストを行った事がありますか?

96ウェルのポリスチレンプレートを使用し、保存時間を15~20分間に延ばして、Opti-MEM中で希釈されたX-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬の安定性をテストしました。これらの状況下では、トランスフェクション効率が40%低下し、再現性確認用の実験結果ではさらに悪くなりました。多分これはウェルへの試薬の吸着が原因と考えられます。ポリプロピレンではない他の材質のプレートを使用する事による効果は確認されていません。
しかしながら、これらの結果から、"希釈されたsiRNAはOpti-MEM中で希釈されたトランスフェクション試薬との結合は5分以内に行う事"を強く推奨します。
もし実験のセットアップ上、5分間以上の保存が必要な場合、1つの可能性としてトランスフェクション試薬量を増加する事は、効果があるかもしれません。

DOTAPでどのようなセルタイプがトランスフェクションできていますか?

DOTAPでうまくトランスフェクションされたプライマリーセルとセルラインのリストが集められています。この情報は、主に使用されているお客様よりのフィードバックを元にしています。またプロトコールと参考文献は別途インターネット上で確認ができます。
HeLa,K-562、Jurkatセルに関しましてはX-tremeGENE Q2の使用を推奨します。

異なるセルタイプに対してのGeneticin ( G 418 )の最適な使用濃度は?

テストされている全てのセルラインに対する最適な使用濃度は添付の説明書に記載されています。 それ以外の細胞に関しては、個々の実験で確認してください。詳細な情報は添付の説明書等で確認してください。

X-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬を使用し、プライマリー肺繊維芽細胞でのsiRNAによるジーンサイレンシングがうまくいったデータ等はありますか?

この試薬を使用して頂いているお客様からの情報によると、通常のラット肺繊維芽細胞でうまく行っているようです。この場合ルシフェラーゼGL2に対しての非特異的なsiRNAか、またはFGF2に対して特異的なsiRNAとFGF2用の高発現プラスミドの両方を同時にトランスフェクションし、成功しているようです。この場合、9 μL X-tremeGENEトランスフェクション試薬を1 μgのトータル核酸比で行われています。
トランスフェクション後、細胞は66時間後に回収され、FGF2発現をウェスタンブロットによって解析されています。β-アクチンの発現は、ローディングコントロールとして使用されています。非特異的なGL2 siRNAは、FGF2とβ-アクチンの両方の発現を低下させていませんでした。またFGF2特異的siRNAの導入により、最初の実験でFGF2の発現は45%低下しています。β-アクチンの発現には影響を与えていませんでした。この結果より、これまでの試薬では不可能であった、例えばプライマリーセルに対してプラスミドとsiRNA両方のトランスフェクションを効果的に行う事ができます。

抗生物質存在下でトランスフェクションを行う事ができますか?

トランスフェクションの間、抗生物質の添加は避けてください。ある種の細胞では、10-15%のトランスフェクション効率の低下が見られました。トランスフェクション後、少なくとも4から6時間後に添加してください。

"トランスフェクションが困難"とされるセルラインでのsiRNAのトランスフェクションがうまくいったデータ等はありますか?

X-tremeGENE siRNAトランスフェクション誌薬を使用したsiRNAのトランスフェクションは、お客様のラボで、下記の困難とされている幾つかの哺乳類セルラインでうまくいっています。
・MCF-10A human mammary epithelial cells
・MDA-MB-468 human mammary carcinoma cells
・HUH-7 human hepatocellular carcinoma cells
・WI-38 human lung fibroblasts
・NIH3T3 murine embryonic fibroblast cell line
・MEF wild-type spontaneously immortalized murine embryonic fibroblasts

その他

BMコンディムドH1はT細胞ハイブリドーマの培養にも使用できますか?

はい、BM Condimed H1は同様にT細胞ハイブリドーマの培養にも適します。T細胞成長因子として、20 U/mL IL-2(mouseあるいはhuman)の培地への添加を推奨します。

BM Cyclinと一緒に使える抗生物質は何ですか?

更なる抗生物質の添加は、毒性が非常に強くなるため推奨できません。

BMサイクリンに興味があります。プラスモチンと比較してBMサイクリンをマイコプラズマ陽性培養細胞の処理に使用したデータはありますか?

バイオケミカの1996年No. 1に、マイコプラズマ除去試薬(MRA)とシプロフラキサシン(ciproflaxacin)、BMサイクリンの比較が記載されています。前者の2つの抗生物質はフルオロキノロン類に属し、BMサイクリンはプレウロムチリンとテトラサイクリンの誘導体の2つの抗生物質より構成されています。それゆえ、この記事の比較データは、プラスモチンにも部分的に適用できます。
端的に言って、マイコプラズマ汚染培養細胞の84%がBMサイクリンの処理で回復されました(シプロフラキサシン処理では77%、MRA処理では64%)。わずか5%のBMサイクリン処理細胞が処理に対して試薬抵抗性を保ちました (シプロフラキサシン処理では14%、MRA処理では22%)。処理による毒性効果を示した細胞の比率は、3種類の試薬で同等でした。

ニュートリドーマCSは、ハイブリドーマ細胞株の培養にサプリメントとして使用できますか?

いいえ、Nutridoma-CSは無血清培地中での選択とクローニング操作中の、新たに融合されたハイブリドーマの増殖に適するように成分が調製されていますので、細胞株の培養には適しません。          

ロシュ社のAnti-Poly (ADP-Ribose) Polymeraseは植物由来のPARPタンパク質を検出できますか?

該当の抗体が植物のPARPを検出するかどうかは試験していませんし、これに関するユーザーからのフィードバックもありません。この抗体はリコンビナントのヒトPARPを免疫源としています。論文によると、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼは非常に保存性の高い酵素として知られています。Arabidopsis thalianaの完全長cDNA(app)は、脊椎動物のポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP; EC 2.4.2.30)の触媒ドメインと高い相同性(約60%)を持つタンパク質をコードしています。Arabidopsisタンパク質のN-末端伸長部位は、植物のPARPとしての核の局在や推定される機能と一致する、様々な核およびDNA結合タンパク質のドメインとの類似性を示します。トウモロコシの核の粗抽出液は、約114 kDaのポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(ヒトPARPは113 kDaのサイズ)の分子量を示します。これらすべての情報に従うと、我々の抗体は完全長のタンパク質の様々なエピトープを認識するポリクローナル抗体のため、植物のPARPを検出することは可能です。ただし、これを保証することは出来ませんので、ご自身でお試しください。

Anti-Poly (ADP-Ribose) Polymeraseの濃度を教えてもらえますか? また、免疫沈降での使用濃度はどうでしょうか?

製品はポリクローナル血清のため、濃度値は提供していません。推奨する使用濃度は、ウェスタンブロットで1.0-0.5 μL/mL(ブロッキングバッファー中)です。-15~-25℃で保存する場合、この抗体を10倍まで希釈して使用できます。
免疫沈降でのこの製品のアプリケーションは、経験がありませんが、IPにおける血清の典型的な濃度である1-5 μL /反応を試してください。anti-PARPを使用してのIPのプロトコールは以下の論文で見つかります。
Dantzer,F., H.P.Nasheuer, J.L.Vonesch, G.de Murcia and J.Menissier-de Murcia (1998). Functional association of poly(ADP-ribose) polymerase with DNA polymerase alpha-primase complex: a link between DNA strand break detection and DNA replication. Nucl Acids Res 26:1891-1898.

Anti-ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼは凍結切片の免疫蛍光染色に使用できますか?

社内データとしてはとっていないのですが、凍結切片でも使用できるはずです。ただし重要なことは、凍結切片に抗体をアプライすると、核の染色のみが得られることに注意してください。この方法では切断および未切断PARPを区別することは出来ないので、アポトーシス細胞を検出することは出来ません(これはAnti-PARPの免疫蛍光アプリケーションにおける一般的な事項です)。抗体は、113 kDaの完全長タンパク質と89および24 kDaフラグメントを認識します。それゆえ、PARP切断産物の検出はウェスタンブロッティングでのみ可能です。

様々なキットで分析する前に、サンプルをどの温度で、どれぐらい保存できますか?

-精製された細胞質サンプル - 20°Cで2週間は保存できます(いくらかのシグナルの低減はあるとしても)。
キット Cell Death Detection ELISA PLUSや 10x (with conc. reagent solutions)

-精製DNAは- 20°Cで1年間保存できます。
キット Apoptotic DNA Ladder Kit

-細胞は生きた状態で、アポトーシス誘導の後に直接使用します。
製品 Annexin V-FLUOS Staining Kit、Annexin V-Biotin

-精製された細胞質サンプル - 20°Cで2週間は保存できます。
キット Cellular DNA Fragmentation ELISA

キットの内容成分は個別に注文することが出来ますか?

以下の単品が個別に注文できます。
TUNEL APTUNEL POD
TUNEL EnzymeTUNEL Label MixTUNEL Dilution Buffer

Colcemid (Cat. No: 1295892001)を-20°Cで保存することは可能ですか? また、その温度での保存で活性は失いませんか(推奨温度は2~8℃ですが)?

長期保存でも4℃保存を推奨します。-20℃での安定性のデータは取っておりません。

どのタイプのサンプルがAnti-PARPで分析できますか?

Anti-PARPはウェスタンブロッティング、免疫蛍光、免疫沈降で使用できます。抗体は完全長(霊長類とげっ歯類で113 kDa)と、カスパーゼにより産生されるラージPARPフラグメント(89 kDa)を認識します。
組織切片、接着細胞、サイトスピン、細胞スメアなどがこのアッセイで使用できました。(注記:しかしながら、免疫蛍光の前には、サンプル材料は架橋系の固定液(メタノールやパラフォルムアルデヒド)で保存されていなければなりません。)

96ウェルプレートの同一ウェルで、MTT/XTT/WST-1とBrdUを同時に行うことは可能ですか?

MTT/XTT/WST-1は生存細胞の代謝活性を測定する際に異なるテトラゾリウム塩を使用しています。それぞれのキットは異なる波長を必要とし、MTTは550 nm、XTTは492 nm、WST-1は420-480 nmです。それぞれの塩からのシグナルの区別は困難です。

それぞれ独自に実行されたキット感度と測定直線域は、MTT/XTT/WST-1を組み合わせたときに混乱します。それゆえ、MTT/XTT/WST-1の同時測定は推奨できません。細胞の生存活性と細胞増殖の同時測定は、細胞増殖ELISA、BrdU(発色)と細胞増殖試薬WST-1の組み合わせで実行できます。Apoptosis and Cell Proliferation, 2nd edition のpage 78の図55をご覧ください。

製品の選び方

細胞増殖測定・BrdU

細胞の活性化と増殖の間のDNA合成を定量するためにどの製品が使用できますか(発色ならびに発光検出)?

Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric)Cell Proliferation ELISA, BrdU (chemiluminescent)が使用できます。これらのアッセイは発色および発行検出での第2世代のELISAです。その方法は、BrdUでの細胞のインキュベーションと、それに続く取り込みBrdU標識物の免疫検出です。使用できるサンプルは浮遊細胞と接着細胞です。必要な時間は、1.5-2.5時間(+細胞の標識)です。

細胞の生存活性、増殖、細胞毒性の定量にどのキットが推奨できますか?

細胞増殖キットI(MTT)細胞増殖キットII(XTT)、あるいは細胞増殖試薬WST-1の使用を推奨します。これらのアッセイは、マイクロプレートフォーマットでの発色による測定用のフォルマザン色素を形成するテトラゾリウム塩の切断に基づいています。使用できるサンプルは接着および浮遊培養細胞です。必要な時間は色素によるインキュベーションに依存しますが、5-28時間です。
詳細情報は細胞増殖測定のページをご覧ください。

酵母細胞やバクテリアの増殖や発育を測定するために細胞増殖キット(BrdU, XTT, MTT, WST-1)を使用することが出来ますか?

我々にはその経験がありませんし、これらのキットはそういう目的用には開発されていません。バクテリアや酵母の増殖を測定する最も簡単な方法は、ODを測定することです。

個々の増殖細胞中のBrdU標識DNAの検出にはどのキットを使用するべきでしょう?

BrdU Labeling and Detection Kit I やBrdU Labeling and Detection Kit IIの使用を推奨します。これらのアッセイは、第一世代の免疫染色アッセイで、蛍光顕微鏡(キットI)と光学顕微鏡(キットII)用があります。方法としては、BrdUでの細胞のインキュベーションや動物へのBrdUの注射、その後の細胞や組織切片のヌクレアーゼによるDNA分解、取り込まれた標識BrdUの免疫検出(Anti-BrdUと二次抗体による)です。使用できるサンプルは、培養および新たに分離された細胞、取り出された組織や組織切片です。必要な時間は約2-3時間(+BrdU標識時間)です。

アポトーシス・細胞死

カスパーゼ3の特異的、定量的in vitro測定を行うにはどのアッセイを使用すべきでしょうか?

Caspase 3 Assay Kit, Fluorimetricの使用を推奨します。これは蛍光ELISA法のキットです。方法は細胞の溶解、それに続くカスパーゼ3の抗体による捕捉、基質の酵素的分解の蛍光による測定です。使用できるサンプルは細胞ライセートとリコンビナントのカスパーゼ3(CPP32)です。必要な時間は約5時間です(アポトーシスの誘導後)。

マイクロプレート中でカスパーゼの特異的、定量的in vitro測定を行うにはどのアッセイを使用すべきでしょうか?

Homogeneous Caspases Assayの使用を推奨します。この方法は細胞溶解と、それに続くカスパーゼ活性の測定(基質DEDV-ローダミン110の酵素的切断を蛍光で測定)です。アッセイはカスパーゼ2,3,7に特異的で、6,8,9,10はより低い程度に検出されます。使用できるサンプルは培養細胞、リコンビナントのカスパーゼです。必要な時間は約2時間です(アポトーシスの誘導後)。

HeLa細胞でのアポトーシス誘導のための陽性コントロールとして何を推奨しますか?

使用する化学物質のタイプと濃度は細胞株により異なります。アポトーシスの陽性コントロールとしては、HeLa細胞をTNFα(10 ng/mL) + アクチノマイシンD(5 μg/mL )で処理することを推奨します。

アポトーシスの検出において、フローサイトメトリーで使用できる製品は?

アポトーシスの初期のステージでカスパーゼにより切断されたPARPの検出に、どの製品が推奨されますか?

Anti-PARPの使用を推奨します。これはウサギ由来のポリクローナル抗血清です。抗体は霊長類とげっ歯類の完全長のポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP、113 kDa)と、カスパーゼにより産生されたラージPARPフラグメント(89 kDa)を認識します。Anti-PARPはウェスタンブロッティング、免疫蛍光で使用できます。ウェスタンブロットでは、SDS-PAGEで分離され、メンブレンにブロットされたアポトーシス細胞抽出物に抗体が結合し、完全長のPARPと切断フラグメントを間接免疫検出します。必要な時間は、5.5時間(免疫検出のみ)です。

アガロースゲル電気泳動での細胞死の検出にはどのキットを使用すべきでしょうか?

Apoptotic DNA Ladder Kitの使用を推奨します。これは全血や培養細胞で使用できるDNA精製キットです。方法は、細胞の溶解とそれに続くガラスファイバーへのDNAの結合、不純物の除去、DNAの回収です。DNA調製に必要な時間は20分以下です(アポトーシスの誘導後)。アポトーシスのラダーはその後のアガロースゲル電気泳動で可視化できます。

光学顕微鏡でのアポトーシス細胞中のDNA切断の検出にはどのキットを推奨しますか?

In Situ Cell Death Detection Kit, APIn Situ Cell Death Detection Kit, PODの使用が推奨されます。これらは間接TUNEL標識アッセイです。使用できるサンプルは、細胞スメア、接着細胞、浮遊細胞、サイトスピン、凍結および固定組織切片です。この方法はフルオレセイン-dUTPでDNAを末端標識し、取り込まれたフルオレセインに対する抗体で検出、基質により可視化します。アッセイ時間は3時間です(+サンプル調製、浸透化など)。

細胞DNAフラグメンテーションELISA中のBrdUで、接着細胞を効率的に標識するプロトコールはありますか?

接着細胞を標識するための特別なプロトコールというのはありません。プロトコール中の"細胞標識プロトコール"に従い、記載の範囲で最初に播種してください。次にBrdUを加え、インキュベートし、細胞が浮いてくるようになった場合は遠心し、慎重にBrdUを含んだ培地を除去し、BrdUフリーの培地を加えてください。次に、接着細胞の場合、標識後にスクレーピングします。能書に従い、アッセイを進めます。

細胞を標識せずにアポトーシスを定量したい場合は、どのキットを使用すべきでしょうか?

細胞死検出ELISA PLUSを使用してください。これは1ステップサンドイッチELISAです。 方法は細胞を溶解し、次にマイクロプレートウェル中のヒストン複合型DNAフラグメント(ヌクレオソーム)を免疫検出します(ネクローシスの検出には、細胞を溶解せずに培養上澄み中のヒストン複合型DNAフラグメントを直接検出します)。サンプルとして細胞ライセート、細胞培養上澄み、血清、血漿が使用できます。必要な時間は3時間(アポトーシスの誘導後)です。

Fas発現細胞にアポトーシスを誘導する製品はどれが推奨できますか?

Anti-Fas (CD95/Apo-1)、モノクローナル抗体、クローン2R2、マウスIgG3が使用できです。使用できるサンプルは浮遊細胞と接着細胞です。抗体はFas-リガンドを模倣してFasレセプターに結合することで培養細胞にアポトーシスを直接に誘導します。必要な時間は3-5時間(アポトーシスの誘導)です。

ネクローシスや細胞介在細胞障害性で遊離した、あるいはアポトーシス細胞の細胞質内にある、BrdU標識DNA断片の定量には、どのキットが推奨できますか?

Cellular DNA Fragmentation ELISAの使用を推奨します。そのタイプは発色サンドイッチELISAです。使用できるサンプルは、BrdUで標識された培養細胞からのセルフリー上澄みや細胞の細胞質ライセートです。方法としては、BrdUによる細胞の前標識と、それに続く、サンプル中のBrdU標識DNAフラグメントの免疫検出です。必要な時間は、約4.5-5.5時間です(+BrdU標識と細胞死の誘導)。

フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡でアポトーシス細胞中のDNA鎖切断を検出するにはどのキットを使用すべきでしょうか?

In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein かIn Situ Cell Death Detection Kit, TMR red の使用を推奨します。これらは直接TUNEL標識アッセイです。方法としては、フルオレセイン-dUTPでDNAを末端標識し、次に蛍光細胞を直接分析します。使用できるサンプルは、浮遊細胞、接着細胞、細胞スメア、凍結およびパラフィン包埋組織切片です。試験時間は約1-2時間(+サンプル調製、浸透化など)。

組織中のアポトーシスを検出するキットはありますか?

In vitroでの測定で、どのようにアポトーシスを定量化すればよいでしょうか?

アポトーシスのin vitroでの定量的測定用に、 以下の製品を提供しています。
ELISA
Cell Death Detection ELISA PLUS
Cell Death Detection ELISA PLUS, 10x(濃縮試薬溶液を含む) 
Caspase 3 Assay Kit, Fluorimetric
Homogenous Caspase Assay, fluorometric
FACS / 蛍光顕微鏡
In situ cell death detection Kit, TMR red
In situ cell death detection Kit, Fluorescein
Annexin-V-Alexa 568
Annexin-V-FLUOS
Annexin-V-FLUOS Staining Kit
M30 Cyto Death, Fluorescein

上皮組織や細胞でのアポトーシスの検出にはどのキットを使用するべきでしょうか?

我々は、M30 CytoDEATH KitかM30 CytoDEATH, Fluoresceinの使用をお勧めします。
検出のタイプ:モノクローナル抗体、クローンM30、マウスIgG2b。抗体は、細胞骨格タンパク質であるサイトケラチン18(CK18)のカスパーゼ切断、フォルマリン抵抗性エピトープに結合します。抗体の免疫活性は、アポトーシス細胞の細胞質に限られます。その方法は固定化サンプルにM30抗体をアプライし、その後に二次検出システムでアポトーシスを検出します。これは、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリーに適しています。使用できるサンプルは、浮遊細胞、接着細胞、組織サンプル(通常のパラフィン包埋切片や凍結切片)です。必要な時間は細胞の免疫傾向では2時間、組織染色では3.5時間(脱パラフィンを除く)。

細胞死検出ELISAと、細胞死検出ELISA PLUS の違いは何ですか?

細胞死検出ELISA細胞死検出ELISAPLUSは、アポトーシスのDNAフラグメンテーションの検出用の基礎的な試薬は同等です。プラスキットは、アッセイ時間を2時間に短縮できるストレプトアビジンコート済みマイクロタイタープレートを利用した、より簡単なプロトコールの第2世代キットです。2つのキットの感度とアプリケーションは同じです。

障害/死細胞から放出されたLDH活性の定量にはどのキットを使用するべきでしょうか?

Cytotoxicity Detection Kit, LDHやPLUSキットを使用すべきです。これらは、マイクロプレートフォーマットでの発色アッセイです。方法は、細胞フリーの上澄の調製と、それに次ぐフォルマザンを形成するINTと上澄のインキュベーションです。発色産物は、吸光度計で定量できます。使用できるサンプルは、培養細胞からのセルフリーの上澄や培養細胞を含む培地で、必要な時間は0.5-1時間です(+細胞死の誘導)。

細胞死検出ELISAと細胞死検出ELISA PLUSの違いは?

細胞死検出ELISAは2ステップの発色ELISAで、自身でマイクロプレートにAnti-ヒストンをコーティングする必要があります。
細胞死検出ELISA PLUSは、1ステップサンドイッチELISAで、プレートはストレプトアビジンでコート済みです。

膜の転座によるアポトーシス細胞の検出と、アポトーシスとネクローシスの分別で推奨できる製品はどれですか?

直接蛍光検出には、Annexin-V-FLUOS、Annexin-V-FLUOS染色キット、Annexin-V-Alexa 568を推奨します。これらの製品は、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡のための直接蛍光染色に使用されます。使用可能なサンプルは、細胞株(接着と浮遊)、新たに分離された細胞などです。これらのテストは、細胞膜の転座(ホスファチジルセリンの移動)によりアポトーシスを検出し、アポトーシスとネクローシス細胞を分別します。この方法は細胞表面のホスファチジルセリンを(アネキシンV-FLUOS (緑)やアネキシンV-Alexa 568(赤)で)染色し、ネクローシス細胞の膜の漏れを(ヨードプロピディウムで)同時染色します。必要な時間は約15分(アポトーシス導入後)です。
間接蛍光検出には、Annexin-V-Biotinを推奨します。この製品は、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、光学顕微鏡分析のための間接蛍光染色に使用されます。使用可能なサンプルは、細胞株(接着と浮遊)、新たに分離された細胞などです。これらのテストは、細胞膜の転座(ホスファチジルセリンの移動)によりアポトーシスを検出し、アポトーシスとネクローシス細胞を分別します。この方法は細胞表面のホスファチジルセリンを(アネキシンV-ビオチンで)染色し、ネクローシス細胞の膜の漏れを(ヨードプロピディウムで)同時染色し、ビオチンを(標識ストレプトアビジン/アビジンで)検出します。必要な時間は約75分(アポトーシス導入後)です。

酵素

コラゲナーゼDとリベラーゼブレンザイム4の違いは?

従来のコラゲナーゼの調製品は、バクテリア(Clostridium histolyticum )の培養上澄を濃縮したものです。これらの調製品は不均質で、30種類の酵素、細胞残渣、色素、エンドトキシンを含んでいます。
エンドトキシンレベルと変動性は従来のコラゲナーゼの最も顕著な欠点です。リベラーゼ酵素は従来のコラゲナーゼとは違う大きな利点を提供します。各リベラーゼ精製酵素ブレンドは、応答表面モデルを使用してアプリケーションごとに特異的な組成を持っていますので、至適な結果が以下において、期待されます。
-細胞収量の増加
-細胞の生存活性の改善
-細胞の機能の維持
リベラーゼのすべてのロットは、同じ酵素活性の規格を持っています。各ロットはエンドトキシンが首尾一貫して低いレベルであることを試験されています。ロット検定やロットの保管予約が必要ありません。各ロットはその組織分散プロトコールにおいて同じパフォーマンスを持つことが保証されています。

Wunschユニットとは何で、FALGPAやMandlユニットとどう相関しますか?

FALGPA U/mgからWunsch U/mgへの換算はFALGPA U/mgを3.9で割算
例 3.5 FALGPA U/mg/3.9 = 0.9 Wunsch U/mg
CDU/mg またはMandl U/mgからWunsch U/mgへの換算はCDU/mgを1000で割算
例 200 CDU/mg/1000 = 0.2 Wunsch U/mg

私の組織分散に最適のリベラーゼを見つけるにはどうすればいいでしょうか?

リベラーゼ酵素の選択法は、現在の組織分散プロトコール、従来のコラゲナーゼで成功している範囲に依存します。組織分散アプリケーション、メーカー、コラゲナーゼのタイプに基づきリベラーゼブレンドを選択してください。以下のリンクをクリックして、最適のリベラーゼを選択してください。
組織別 分散酵素適合表:組織分散アプリケーション、推奨されるリベラーゼ酵素ブレンド、開始濃度が随時アップデートされている表です。表には、各アプリケーションのプロトコールのフルテキストがリンクされています。
【参考】他社酵素対応表 :各メーカーのコラゲナーゼとリベラーゼの互換性の表です。
【参考】リベラーゼ新旧対応表 :あなたのアプリケーションがリストに載っていない場合、リベラーゼ製品を選択する元になるものが無い場合は、このリンクを使用してください。リベラーゼブレンザイム3は従来のコラゲナーゼの"高品質"のほとんどのロットに置き換えられるようにデザインされており、様々なタイプの組織の分散用の良い開始点です。

トランスフェクション

RNAのトランスフェクションが可能な試薬はどれですか?

RNAのトランスフェクションに対しては、DOTAPリポソーマル・トランスフェクション試薬の使用を推奨します。

哺乳類細胞へのsiRNAのトランスフェクションそしてsiRNAのコトランスフェクションに一番適した試薬は何ですか?

X-tremeGENE siRNAトランスフェクション試薬は、HeLa、NIH 3T3、HEK-293、CHO-K1、COS-7や、"トランスフェクションの困難な"セルラインであるHT29( human adenocarcinoma cell line )等を含む、多くの一般的に使用される哺乳類細胞中へのsiRNAの導入を効果的に行う事ができます。
コトランスフェクション・ベースのジーンノックダウンにX-tremeGENE siRNA試薬を使用すると、トランスフェクション効率が高いため、高いタンパク質発現と効果的なノックダウンレベルを可能にします。

p53

野生型とミュータントのp53タンパク質の定量にはどの製品が使用できますか?

発色サンドイッチELISAであるp53 pan ELISAが使用できます。使用できるサンプルは組織ホモジネート、細胞ライセート、血清および血漿です。方法はサンプルの溶解/ホモジナイズと、それに続くp53のマイクロプレートでの免疫化学測定です。必要な時間は約2.5時間です。

免疫組織化学やウェスタンブロットでp53を検出するために使用できる製品はどれですか?

ヒツジ由来ポリクローナル抗体のAnti-p53 (pan) の使用をお勧めします。これは、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モンキー、ウシ、ニワトリのミュータントと野生型のp53を認識します。

トラブルシューティング

細胞増殖測定・BrdU

ブロモ-2'-デオキシウリジン ラベリング&デテクションキットIIで、高バックグランドにどうすれば対処できますか?

Bromo-2'-deoxy-uridine Labeling and Detection Kit IIの使用には以下のことに注意してください。
a) anti BrdU-PODはある種のプラスチック材に非特異的に結合します。抗吸着剤が塗られた平底の滅菌マイクロタイタープレートを使用してください(NUNCやCostarのMaxisorpなど)。常に滅菌平底マイクロプレートを使用してください。抗体を加える前に、PBS/1% BSAでブロッキングを行います。ブロモデオキシウリジンのマイクロプレートへの非特異的な結合は、ウェルの表面を変化させるポリリジンの使用により克服できます。
b) 他の可能性:anti-BrdUは洗浄ステップの後常に洗い流されるわけではありません。この場合は、洗浄ステップ数を増やしてください(1-3分、4-5回)。これらの観点の下に、バックグランドコントロールでの高いODの最もそれらしい理由:ある種の細胞株は、2x104 /mL以上の高い細胞数において、抗体の非特異的結合を見せます。多分、これは特殊な細胞外マトリックスが原因と考えられます。細胞数を減らすと改善されるかもしれません。

ヒトリンパ球を刺激し、細胞増殖ELISA,BrdUで測定したとき、値が低すぎました。この理由はどう考えられますか?

リンパ球の増殖を研究するためには、細胞は成長因子、サイトカイン、マイトゲンなどで刺激されます。細胞数の増加(特別な場合)は、リンパ球の凝集塊を導きます。同じ由来の細胞は一緒に張り付き、培養細胞中で凝集します。この効果は、ELISA系での抗体の認識を妨害し、応答を過小評価する結果となります。シグナルの変動を避けるために、BrdU標識期間の後で、培地を除去する前に、ピペッティングで細胞を注意深く再懸濁します。これにより、BrdU標識への抗体の認識のための細胞への近接性が等しくなります。
この問題はほとんど、リンパ球などの浮遊細胞に影響します。この問題を接着細胞で経験したなら、標識時間が完了した後、標識培地を除去し、単一細胞にするためにトリプシン処理を行い、マイクロプレートを遠心し、浮遊細胞の操作法に従い、細胞を乾燥させ、標準的な操作法を続けます。

アポトーシス・細胞死

細胞死検出ELISAを使用した後、上澄のタンパク質濃度を測定したいと思います。Bradford (BIO-RAD)法を試してみたのですが、うまく行きませんでした。何か推奨することはありますか?

BCA法を使用します。Lowry法の欠点は、ある種の物質、しばしばバッファーに使用される塩と界面活性剤によりフォーリン試薬の反応が妨害されることです。BCA法はBicinchononic acid(BCA)を代替の検出試薬として使用します。BCAは、水溶性のNa塩を使用する場合に、高感度で安定な試薬です。

PARPの切断産物を見るためには、レーンあたりに、どれくらいのタンパク質をゲルにアプライすればいいのでしょうか? 使用説明書には溶解すべき細胞数しか記載されておらず、ゲルに載せるタンパク質の量は記載されていません。私の実験では、未切断のものは見えますが、切断産物は見えません。

通常、レーン当り10-50 μgのタンパク質をアプライし、これはPARP切断産物(89と24 kDa)を検出するのに十分です。完全長のバンド(113 kDa)がウェスタンブロットで十分に見えるとのことですが、一つにはアポトーシスの誘導が少なすぎると思われます(誘導時間を長くする-24時間-が助けとなるでしょう)。また、4 μg/mLのcamptothecin(アポトーシス誘導剤)でU 937細胞を4時間インキュベーションした陽性コントロールを作成することを推奨します。また、24 kDa切断産物はウェスタンでは非常に弱くしか検出されないか、まったく検出されないことに注意してください。

数種類のアポトーシスアッセイにおいて、カンプトテシンで4-6時間処理した細胞で何のシグナルも得られません。

データを失った可能性があるかどうかを見るために、カンプトテシンのドースレスポンスとタイムコースを調べてください。4-6時間の処理時間の前あるいは以後に起こったか、使用濃度が違うかを確認します。

In Situ Cell Death Detection Kit( APと PODの両方)とDNase I, grade I.を使用して実験をしています。常に、固定および浸透化組織スライドで陽性コントロールを立てていますが、DNase Iがあっても無くても結果は同じです。DNase Iを変えてみましたがやはり結果は同じです。どこかに間違いがあるのでしょうか?

組織切片の厚さを~10 μMまでに制限してください。DNaseがスライドに効果的に浸透していない可能性があります。また、浸透化のステップを変動させてみてください(インキュベーション時間を長くするなど;至適なインキュベーション条件は実験的に決めてください)。

脳組織切片においてIn Situ Cell Death Detection Kit, PODを使用しています。ある脳部位からの切片では、すべての核が非特異的に染まっています。その理由と回避法は?

一般的に、TUNEL法は培養細胞よりも組織サンプルへの応用が困難です。組織調製の開始点(固定など)と組織の前処理に実際的に重要なファクターがあります。特にこの(DNA切断断片の末端標識に基づく)アッセイのためには、組織調製の間にヌクレアーゼの活性化が(擬陽性染色の原因となる)DNA切断断片を生じるため、組織サンプルを直ちに固定することが重要です。
それゆえ、我々のサジェスチョンとしては、穿刺組織を良好に扱うことに尽きます(直ちに固定、フォルマリンかパラフォルムアルデヒドがベストです)。
In Situ Cell Death Detection Kit, PODや In Situ Cell Death Detection Kit, APのためには、内在性のPOD/APが高いバックグランドや擬陽性の結果となるかどうかをチェックするために、TdTを含まない陰性コントロールを行うことが重要です。
すべての核の非特異的染色の場合、特に組織サンプルにおける我々の経験では、至適な結果を得るための最良の方法は、能書のトラブルシューティングにも推奨されている通り、TdTの希釈です。TdTをTUNEL Dilution Bufferで、1:2から1:10に希釈してください。
通常、一般的な核の非特異的染色は非アポトーシス細胞(特に強く増殖している細胞)にも存在するDNA鎖切断断片が原因です。アポトーシス細胞の測定にTUNEL法を使用した場合、増殖組織はバックグランドを引き起こすことが知られています。興味深いことに、この減少は培養細胞や培養器官では観察されませんが、パラフィン包埋組織で特に観察されます。組織切片中の増殖部位が同じく増強されたアポトーシスの部位であるかを確認するために、(M30 CytoDEATHを使用して、パラフィン包埋組織切片中の、カスパーゼによるサイトケラチン18の切断のような)アポトーシス関連酵素の活性検出など、他のアポトーシスアッセイとの二重染色を行うべきです。
アポトーシス細胞は非常に多くの切断断片を持っていますので、TdT希釈の効果は、非常に多数の断片を持つアポトーシス細胞は標識されるが、少量の断片しか持たない非アポトーシス細胞は標識されないというレベルに、アッセイの感度を減少させます。
それに加え、蛍光の直接標識(In Situ cell Death Detection Kit, Fluorescein)の使用は、非職的なアッセイよりもこのような組織に適しています。直接標識アッセイを適用することで、増殖細胞は多少のかすかなバックグランドを現しますが、本当のアポトーシス細胞は強く輝いているので分別できます。
詳細は、リファレンスであるA. Negoescuらの、"TUNEL Apoptotic Cell Detection in Archived Paraffin-embedded Tissues" (Biochemca 3/1998)をご覧ください。

TUNEL法

低TUNEL標識(低感度)を回避するためのTipsが何かありますか?

これらが原因で起こる低TUNEL標識は以下のように回避できます。

  • エタノールやメタノール固定
    - 4%パラフォルムアルデヒドを固定液として使用します
  • 長い固定反応による過剰な架橋
    - 固定時間を短くします
    - 2%パラフォルムアルデヒドを固定液として使用します
  • 浸透化が不十分なため、TUNEL試薬が核に届いていない
    - プロティナーゼKによる前処理(濃度と時間は実験的に至適化します)
    (注:ヌクレアーゼのコンタミを避けるためにロシュ社のプロティナーゼK、lyoやsolutionを使用してください。)
    - 0.1 Mのクエン酸ナトリウムにより70℃で30分間処理します。 
    - TUNELインキュベーション時間を延長します。
  • パラフィン包埋により、TUNEL試薬の核へのアクセスが制限されている
    - 組織切片の脱パラフィン後、プロティナーゼKによる処理(濃度と時間は実験的に至適化します)
    (注:ヌクレアーゼのコンタミを避けるためにロシュ社のプロティナーゼK、lyoやsolutionを使用してください。)
    - 脱パラフィンした組織切片を200 mLの0.1 Mクエン酸バッファー(pH 6.0) に漬浸し、マイクロウェーブ処理します(370 W、5分)
     (注:条件は各組織ごとに実験的に至適化します)

TUNEL法において非特異的(擬陽性)バックグランドを避ける最適の方法は何でしょうか?

バックグランドの低減のための最適なアプローチは、コントロールで得られた結果によります。

  • ターミナルトランスフェラーゼ不含で、フルオレセイン-dUTPで細胞がインキュベートされたときに、擬陽性が出た場合、よりしっかりと細胞を洗浄するか、フルオレセイン-dUTP濃度を減らすか、別の浸透法を試します。
  • 擬陽性が、フルオレセイン-dUTPとターミナルトランスフェラーゼの両方で反応したときのみに現れるのなら、擬陽性を減らす最適な方法は、酵素濃度を低くするか、浸透法を変更します。

TUNELアッセイにおいて、高いバックグランドを避けるためのコツはありますか?

高バックグランドの原因はいくつかあります。

  • メラニン前駆体を含む細胞は、フォルマリン固定で黄色く染色されます。
    -メタノール固定を行ってください(注記:この固定法はTUNEL標識の感度を減少させる恐れがあります)
  • TUNEL標識ミックスが濃すぎる(例:カルシノーマなど)
    - 30 mM Tris (pH 7.2) 、140 mM sodium cacodylate、1 mM CoCl2.を含むTUNEL Dilution Bufferで1:2に希釈します
  • 内在性のアルカリホスファターゼ活性(AP標識抗体を使用の場合)
    -AP基質溶液に1 mMのレバミゾールを加え、内在性のAP活性をブロックします
  • 内在性のペルオキシダーゼ活性(POD標識抗体を使用の場合)
    -メタノール中0.3% H2O2溶液にスライドを浸し、内在性のペルオキシダーゼ活性をブロックします
  • 標識Anti-フルオレセイン抗体の非特異的な結合
    -正常抗ヒツジ血清で非特異的結合部位をブロックします
    -3% BSAを含むPBSで非特異的結合部位をブロックします(20分)
    -PBSで標識抗体を1:2に希釈します

TUNEL標識で陽性コントロールのシグナルが出ない場合の原因は?

不適切なDNase処理が原因と考えられます(DNase濃度が低すぎる)。
以下のプロトコールを試してください。
- 凍結切片では1 μg/mL DNaseをアプライします
-パラフィン包埋組織切片では0.5 mg/mL DNaseをアプライします
-他の多くののサンプルでは、 1 U/mL DNase(10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 10 mM NaCl, 5 mM MnCl2, 0.1 mM CaCl2, 25 mM KClの溶液中)で、37℃で30分間インキュベートします
-別のバッファーとして、10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM MgCl2, 1 mg/mL BSAの溶液も使用できます

非特異的なTUNELラベルの原因をいくつか挙げてもらえませんか?

以下の原因が考えられます。
● 組織の包埋(メタクリレートなどのUVにより重合化が起こる材料)の間のUV照射が引き起こすDNA切断
-UV照射を必要としない包埋材料を使用します
-別の重合法を使用
● 酸性の組織固定液(mathacarn, Carnoy's fixative)がDNA切断を引き起こす
-4%パラフォルムアルデヒドを固定液として使用します
● 組織調製の後、すぐ起こる内因性のヌクレアーゼ活性(特に平滑筋組織スライス)
-器官を採取後、直ちに組織を固定します
-健康な動物の肝臓静脈を通して固定液を浸透します
●TdT濃度が高すぎる
-30 mM Tris (pH 7.2) 、140 mMカコジル酸ナトリウム、mM CoCl2.を含むTUNEL Dilution Bufferで1:2あるいは1:3に希釈して、TdT濃度を下げます
●内在性のアルカリホスファターゼ活性(AP標識抗体を使用の場合)
-AP基質溶液に1 mMのレバミゾールを加え、内在性のAP活性をブロックします
●内在性のペルオキシダーゼ活性(POD標識抗体を使用の場合)
-メタノール中0.3% H2O2溶液にスライドを浸し、内在性のペルオキシダーゼ活性をブロックします
●標識Anti-フルオレセイン抗体の非特異的な結合
-正常抗ヒツジ血清で非特異的結合部位をブロックします
-3% BSAを含むPBSで非特異的結合部位をブロックします(20分)
-PBSで標識抗体を1:2に希釈します