ポリエチレングリコール(PEG)

2次元および3次元細胞培養用生分解性ポリエチレングリコール

Andrea M. Kasko

Department of Bioengineering
University of California, Los Angeles

Material Matters 2012, 6(3), 9. → PDF版(英語)

はじめに

組織工学や薬物送達などをはじめとするバイオテクノロジー分野の進歩に伴い、さまざまな機能性生体材料の需要が増大しています。過去数十年にわたり、高分子生体材料の研究では、他の用途のために開発されたポリマーの生体適合性の確認やその加工技術の開発(エレクトロスピニング、溶媒キャスト/孔物質溶出(porogen leaching)法、3次元印刷など)に重点が置かれてきました。最近では生体医学用に特化した材料の合成、すなわち合成タンパク質や糖類似体、水媒体との相溶性の高いポリマーの合成に加え、自然界に存在するポリマーの化学修飾(ゲル化やin vivoでの安定性の強化など)へと研究の流れが変化しています。この十年の間では、細胞足場としての利用や治療薬の送達を目的として設計された生体材料の開発などが行われています。

研究者から強い関心が寄せられている生体材料の1つに、ヒドロゲルがあります1。ヒドロゲルは2次元および3次元の細胞足場として広く研究されていますが、それは化学的にも物理的にも本来の細胞の環境に非常に近い状態を模倣しているためです2。ヒドロゲルは、合成ポリマー(ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエチルメタクリラートなど)や天然に存在するポリマー(コラーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリンなど)から合成され1b、その高い水分含有量と、細胞、タンパク質、DNAの存在下で作製可能であるために細胞培養の3次元モデルとして有用な材料です。構成する材料の反応性にもよりますが、pH3、温度4、クーロン相互作用、共有結合/非共有結合性相互作用5、または重合反応を用いることで、ゲル化を行うことが可能です。

PEG

ポリエチレングリコール(PEG)は親水性ポリマーのひとつで、架橋してネットワークを構成させることで大量の水を保持することができます。一般的にPEGは免疫反応を引き起こさないため、生物学的応用に適した材料です6。1970年代以降、治療用タンパク質やペプチドを修飾することによる溶解度の向上や毒性の低下、循環滞留性の向上のためにPEGは使われてきました7。そして、1970年代後半になると、PEGヒドロゲルを用いた細胞培養の実験が始まりました。PEGヒドロゲルは化学組成が明確であり、その合成や化学修飾に多様な化学を利用することができます。

PEGマクロモノマー

PEGはエチレンオキシドのリビングアニオン開環重合によって合成されます。そのため、多様な末端基(例えば、アルコール、メチルエーテル、アミン、N-ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)エステル)を持ち、広い範囲にわたってさまざまな分子量を持つ、よく定義された(多分散性が低い)PEGを容易に得ることができます。

ヒドロゲルの形成にはPEGの架橋が必要です。初期の頃は、電離放射線を用いて非特異的に架橋されていました8。現在では、PEGヒドロゲルの合成には、PEGマクロモノマーの反応性鎖末端を利用して共有結合的に架橋させる方法が一般的に用いられています。

アクリラート、メタクリラート、アリルエーテル、マレイミド、ビニルスルホン、NHSエステル、ビニルエーテル基などの反応性鎖末端を持つPEGマクロモノマー(表1)は、入手の容易な出発物質から簡便に合成されます。PEGのアルコール鎖末端は、塩基存在下で、塩化アクリロイル、塩化メタクリロイルなどの酸性塩化物を用いてエステル化することができます。PEG鎖末端は、塩基性条件下で、2-chloroethyl vinyl etherやallyl bromideなどのハロゲン化アルキルと反応させることでエステル化が可能です。PEGジビニルスルホンは、PEGを大過剰のジビニルスルホンとカップリングさせるか、あるいは、クロロエチルスルホン鎖末端を調製した後に、塩基を除くことでジビニルスルホン基を導入する多段階プロセスによって合成します9

PEGマクロモノマーのさまざまな末端基

表1 PEGマクロモノマーのさまざまな末端基

マクロモノマーはホモ二官能性、あるいはヘテロ二官能性です。ホモ二官能性のマクロモノマーは主にネットワーク形成に使われ、ヘテロ二官能性マクロモノマーはヒドロゲルネットワーク内への治療薬分子の結合に使われます。

ヒドロゲル形成のメカニズム

ヒドロゲルを形成する架橋メカニズムは、PEGマクロモノマーの鎖末端の特性に依存します。多くの場合、一般的にはラジカル開始剤の存在下で反応性のビニル鎖末端が重合化されたときに架橋が起こります。例えば、レドックス生成ラジカル(過硫酸アンモニウムやTEMEDなど)、あるいは光によって生成するラジカル(例えばIrgacure® 651, λ = 365 nm)を用いて、マクロモノマーの重合を開始させることができます(スキーム1)。アクリラートやメタクリラートの鎖末端は連鎖重合します。一方、遂次重合によるネットワーク形成では、多官能性架橋剤(f > 2)はPEG鎖末端と化学量論的に反応しますが、多官能性PEG(f > 2)を二官能性架橋剤と架橋させることもできます(スキーム1)。アクリラート、メタクリラート、ビニルスルホン、マレイミド、ビニルエーテル、アリルエーテルはすべて、反応条件を調整してチオールへ変換させることで、遂次重合によるネットワーク形成が可能です。代表的な架橋剤には、チオールまたはアミン系の構造が含まれています。混合モードでの重合は、同一の反応槽中で両方のメカニズムが生じることによるもので、アクリラート基とメタクリラート基は混合モードでネットワーク形成することができます。どちらのヒドロゲル生成メカニズムも生細胞のカプセル化に利用可能であり、ペプチドやタンパク質、その他治療薬の活性を保ちながら導入することができます。

連鎖重合と遂次重合反応

スキーム1 連鎖重合と遂次重合反応

異なるメカニズムの結果生じたメッシュ構造を図1に示します。連鎖重合で形成されたネットワークでは、成長鎖は架橋サイトに形成されますが、一方の遂次成長によるネットワークでは、欠陥を除く架橋サイトは多官能性架橋剤と同じ官能性を持ちます。連鎖重合と遂次重合のどちらの場合でも、ループ状や完全に絡み合った状態の鎖、ダングリング鎖末端などのネットワーク欠陥が存在することがあります。

マクロモノマーの化学的特性とヒドロゲル形成のメカニズムは、ヒドロゲルネットワークの架橋密度に影響を与える点で、どちらも重要です。2次元、3次元の培養に重要な材料特性は、ヒドロゲル形成の際の化学によって容易に制御できます。架橋密度を高めることで、メッシュサイズは小さくなり、膨潤比が減少し、貯蔵弾性率は増加します。また、PEGマクロモノマーの分子量を変化させると、ヒドロゲルの性質を大まかに制御することができます(架橋密度に大きな違いが生じます)。さらに、ヒドロゲル生成に用いる反応メカニズムを変えることで、ヒドロゲルの性質を細かく制御することが可能です(系の架橋密度の調整に利用されます)。

生成メカニズムが与える、ヒドロゲルのネットワーク構造やネットワーク欠陥への影響

図1 生成メカニズムは、ヒドロゲルのネットワーク構造やネットワーク欠陥に影響を与えます。

分解性ヒドロゲル

細胞分化や組織の形態形成の研究に3次元ヒドロゲル足場を利用するには、ゲルの物理的および化学的性質を空間的、時間的に制御された方法でコントロールすることが極めて重要となります10。一般的には、高分子材料の性質は、重合/架橋(結合の形成現象)、あるいは制御された分解や放出(結合の切断現象)によって変化します。結合生成には、低分子量の化合物(開始剤、触媒、モノマー、材料に結合させる配位子)が使われることがありますが、結合の切断には外部から化合物を追加する必要はまずありません。低分子化合物は高分子化合物よりもin vitroin vivoで大きな副作用を示すことが多いため、多くの研究グループが高分子生体材料のin situの手段として分解反応を用いています。

加水分解

ヒドロゲルの分解で最も一般的に利用される反応は加水分解であり、ポリマー骨格に水分子を添加することで鎖の切断を引き起こします。無水物、エステル類、アミド類は、いずれも加水分解に対し敏感です。通常、無水物の加水分解は早く、アミド類の無触媒加水分解は非常に遅い反応であるため、加水分解によって分解するヒドロゲルの多くはエステル結合を利用しています。生理学的に妥当な分解時間で加水分解するヒドロゲルを得るためには、一般的に、ラクチドやグリコリドを用いた分解性エステル結合によってPEGを官能基化します。

PEGのアルコール鎖末端は3,6-dimethyl-1,4-dioxane-2,5-dioneと1,4-Dioxane-2,5-dioneの開環反応を引き起こし、それぞれPEGラクチドおよびPEGグリコリドを生成します(スキーム211。開環反応には一般的にtin(II)-2-ethylhexanoateを触媒に用いますが12、4-(dimethylamino)pyridine(DMAP)を触媒として用いても容易に反応が進みます13。この場合、おそらく残存スズよりも容易に触媒を除去できます。PEGラクチドあるいはPEGグリコリドのアルコール鎖末端は、アクリラートやメタクリラートなどの反応性二重結合によって容易に官能基化されます。

PEGラクチドとPEGグリコリドの合成

スキーム2 PEGラクチドとPEGグリコリドの合成

ヒドロゲルの分解に加えて、エステル結合の加水分解はヒドロゲルにカプセル化された薬物の細胞への送達に利用されています。例えば、デキサメタゾン14やスタチン15などの治療薬は分解性ラクチド結合によってヒドロゲル中に結合され、持続的に放出されます。そのため、間葉幹細胞(MSCs)を骨芽細胞へ分化させるために使用されています。

酵素分解

エステル結合は酵素によって分解が可能ですが、多くの場合、エステルやアミドの非配列特異的な酵素分解よりも、ヒドロゲル中に導入したペプチドの配列特異的な酵素分解が利用されています。Hubbell のグループはこの手法の草分け的存在で16、アクリラート、マレイミド、ビニルスルホンを介してシステイン官能基化ペプチドをマイケル付加させることによって、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)感受性結合をヒドロゲルに導入しました(スキーム317

MMP分解性結合はまた、治療薬剤をヒドロゲル中に結合するためにも用いられています。例えば、血管内皮増殖因子(VEG-F)のような増殖因子はMMP感受性結合の酵素分解によって放出され、血管形成を誘発します18

加水分解、酵素分解のいずれにおいても、マクロモノマーの化学的性質により分解速度をあらかじめ決めることができます。加水分解の場合、その材料の分解速度は材料特性(例えば疎水性や親水性)や加水分解性官能基の数によって決定され、材料を一度合成してしまえば変更することはできません。酵素分解の場合、反応は一般的に酵素を産生する細胞の近傍で起こります。加水分解や酵素分解はどちらも持続的なヒドロゲルの分解や治療薬の放出に有効な手法ですが、ヒドロゲルを合成した後では放出速度の調整や停止を行うことができず、また、空間的に放出を制御することもできません。

酵素分解性ヒドロゲル

スキーム3 ビニルスルホン基へのシステイン含有ペプチドのマイケル付加によって合成される酵素分解性ヒドロゲル

光分解性ヒドロゲル

加水分解や酵素分解が可能な結合に比べ、光分解性結合の場合には、分解と放出を空間的、時間的に正確に制御できます。多くの研究者が光重合性ヒドロゲルや光機能性ヒドロゲルについて報告していますが、生体適合性光分解性ヒドロゲルの報告はごくわずかです。KloxinとKaskoは2-methoxy-5-nitro-4-(1-hydroxyethyl)phenoxybutanoateを含むPEGマクロモノマー(スキーム4)から合成した光分解性ヒドロゲルネットワークについて報告しており19、オルト-ニトロベンジル(o-NB)結合基の光分解性挙動についての詳細を明らかにしています。光分解性マクロモノマーから合成したヒドロゲルは、露光すると、照射時間、波長、光の強さに応じてバルク分解を起こします。遮光すると分解は停止し、照射を再開すると試料は光分解を続けます。光放出性の細胞接着性配位子RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)を含むヒドロゲルにカプセル化されたhMSCs(ヒト間葉幹細胞)は、10日目にRGDSが放出されると(軟骨形成におけるフィブロネクチンの抑制に対応)、軟骨形成の過程を経て分化します。一方で、この分解性ヒドロゲルの表面エロージョン(侵食)やゲルを用いたリソグラフィは、10-7から10-2 m以上の大きさの形状の作製に用いることができます20。局所的な部分分解による架橋密度の低下と膨潤の増加によって、ヒドロゲルの上に、ゲルから盛り上がった状態のより軟らかい形状をエッチングすることが可能です。

光分解性o-NB結合基部分

スキーム4 治療薬の放出を目的として、ヒドロゲル骨格中に導入された光分解性o-NB結合基部分

o-NBを含むヒドロゲルは、一光子光分解に加えて二光子光分解に対しても感受性があり、3次元エッチングに利用できます19-20。一光子反応では、光が照射されたあらゆる領域で反応が起きます。これに対して、多光子リソグラフィでは、複数の光子が同時に吸収された場所のみ、つまり光源の焦点領域で起きます(図2)。生体材料の一光子リソグラフィで使われる一般的な波長は長波長の紫外線(≧365 nm)から可視領域ですが、二光子リソグラフィでは赤外線(一般的におよそ740~800 nm)が使用されます。赤外線は生体適合性がより高いうえに、生細胞に対する破壊力が小さく、大きな侵入深度が得られます。二光子吸収が起こり得るのも、光路全体に沿った部分というよりは収束光の焦点付近に限られており、三次元的な励起の制御が可能となります。一光子、多光子のどちらの反応も、500 nmよりも微細な形状をパターニングできる可能性を持っており、これは哺乳類の細胞よりも小さな大きさです21。このことは、ヒドロゲルの足場構造や化学的性質をこれまでにない精度で空間的制御することが可能であることを意味しています。

一光子/二光子光分解

図2 一光子光分解()は紫外可視の光で露光されたヒドロゲル全域で起こり、二光子光分解()は赤外光の2つの光子が同時に吸収された部分でのみ起こります。

o-NBリンカーはまた、治療薬をヒドロゲル中に結合して生細胞へと送達するのにも使われます。Griffinらは、o-NB-PEGマクロモノマーを用いてヒドロゲル中に結合したフルオレセインを制御放出できることを示しました22。このモデル治療薬の放出は、さまざまな波長(365~436 nm)や強度(5~20 mW/cm2)、照射時間(0~20分)の光に対する関数として定量的に示されます。最も速い放出が起こるのは波長が365 nm(これはこの波長でo-NBリンカーのモル吸光係数が高くなることと一致しています)のときですが、波長405 nmのときにも顕著な放出が見られます。この放出は化合物の物理定数(モル吸収光係数など)によって容易にモデル化できます。これらの系では、光の減衰によって化学的、機械的な勾配を容易に作製することができます。

結論

ポリエチレングリコールは入手が容易で、簡便に修飾が可能なポリマーであり、組織培養用2次元、3次元の足場をはじめとするヒドロゲルの作製に広く使われています。また、PEGヒドロゲルへの分解性結合の導入は容易です。加水分解性ゲルでは持続的分解や治療薬の放出が可能であり、酵素分解性ゲルではその分解や放出は細胞に大きく影響されます。光分解を用いることで、ヒドロゲルの化学的、物理的性質を、ユーザーの要望に合わせてリアルタイムで外部から操作することが可能となります。

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