CaspaTag Caspase 9 In Situ Assay Kit, fluoresceina

Apoptoza jest zachowaną ewolucyjnie formą samobójstwa komórek, które następuje w wyniku wyspecjalizowanego procesu komórkowego. Centralnym elementem tego procesu jest kaskada enzymów proteolitycznych zwanych kaspazami. Enzymy te uczestniczą w serii reakcji, które są wyzwalane w odpowiedzi na sygnały proapoptotyczne i powodują rozszczepienie substratów białkowych, powodując demontaż komórki1.

Kaspazy zostały zidentyfikowane w organizmach od C. elegans do ludzi. Kaspazy ssaków odgrywają różne role w apoptozie i stanach zapalnych. W apoptozie, kaspazy są odpowiedzialne za proteolityczne rozszczepienia, które prowadzą do demontażu komórki (kaspazy efektorowe) i są zaangażowane w poprzedzające zdarzenia regulacyjne (kaspazy inicjatorowe). Aktywna kaspaza składa się z dwóch dużych i dwóch małych podjednostek, które tworzą dwa heterodimery, które łączą się w tetramer2-4. Podobnie jak inne proteazy, kaspazy są syntetyzowane jako prekursory, które ulegają dojrzewaniu proteolitycznemu, autokatalitycznie lub w kaskadzie przez enzymy o podobnej specyficzności5.

Enzymy kaspazowe specyficznie rozpoznają sekwencję 4 lub 5 aminokwasów na docelowym substracie, który koniecznie zawiera resztę kwasu asparaginowego. Reszta ta jest celem rozszczepienia, które zachodzi na karbonylowym końcu reszty kwasu asparaginowego6. Kaspazy mogą być wykrywane poprzez immunoprecypitację, techniki immunoblottingu z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla kaspaz lub poprzez zastosowanie substratów fluorochromowych, które stają się fluorescencyjne po rozszczepieniu przez kaspazę.

CHEMICON^® CaspaTag Caspase-9 In Situ Assay Kit, Fluorescein to fluorescencyjny test do wykrywania aktywnej kaspazy-9 w komórkach ulegających apoptozie. Zestaw jest przeznaczony wyłącznie do użytku badawczego. Nie jest przeznaczony do stosowania w procedurach diagnostycznych lub terapeutycznych.

Zasada testu

Zestawy CHEMICON ′s CaspaTag Caspase-9 In Situ Assay wykorzystują nowatorskie podejście do wykrywania aktywnych kaspaz. Metodologia opiera się na fluorochromowych inhibitorach kaspaz (FLICA). Inhibitory są przepuszczalne dla komórek i nie są cytotoksyczne. Po wejściu do komórki inhibitor wiąże się kowalencyjnie z aktywną kaspazą 7. Ten zestaw wykorzystuje znakowany karboksyfluoresceiną fluorometyloketonowy peptydowy inhibitor kaspazy-9 (FAM-LEHD-FMK), który wytwarza zieloną fluorescencję. Po dodaniu do populacji komórek, sonda FAM-LEHD-FMK wchodzi do każdej komórki i kowalencyjnie wiąże się z reaktywną resztą cysteiny, która znajduje się na dużej podjednostce aktywnego heterodimeru kaspazy, hamując w ten sposób dalszą aktywność enzymatyczną. Związany znakowany odczynnik jest zatrzymywany w komórce, podczas gdy niezwiązany odczynnik dyfunduje z komórki i jest wypłukiwany. Zielony sygnał fluorescencyjny jest bezpośrednią miarą ilości aktywnej kaspazy-9 obecnej w komórce w momencie dodania odczynnika. Komórki zawierające związany znakowany odczynnik mogą być analizowane za pomocą fluorometrii opartej na płytkach 96-dołkowych, mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej.

CaspaTag Caspase-9 In Situ Assay Kit, Fluorescein do cytometrii przepływowej to oparty na fluorescencji test do wykrywania aktywnej kaspazy-9 w komórkach poddawanych apoptozie.

Research Category
Apoptosis & Cancer

- Nieotwarte materiały zestawu należy przechowywać w temperaturze 2-8°C do daty ich ważności.

- Odtworzony odczynnik FLICA (150X) należy zamrozić w temperaturze -20°C na okres do 6 miesięcy i w tym czasie można go dwukrotnie rozmrozić. W razie potrzeby rozdzielić do oddzielnych bursztynowych probówek. Chronić przed światłem przez cały czas.

- Przechowywać rozcieńczony (1X) bufor płuczący w temperaturze do -20°C przez 2 tygodnie.

FLICA Reagent (FAM-LEHD-FMK): One lyophilized vial

10X Wash Buffer: 15 mL

Fixative: 6 mL

Propidium Iodide: 1 mL at 250 μg/mL, ready-to-use

Hoechst Stain: 1 mL at 200 μg/mL, ready-to-use

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Unless otherwise stated in our catalog or other company documentation accompanying the product(s), our products are intended for research use only and are not to be used for any other purpose, which includes but is not limited to, unauthorized commercial uses, in vitro diagnostic uses, ex vivo or in vivo therapeutic uses or any type of consumption or application to humans or animals.