Not I

Not I は配列GC?GG*C*CG°Cを認識して、5′-付着末端を有するフラグメントを生成します。
Not I は「低頻度切断」酵素のクラスに属します。8量体配列（GとC残基のみから構成される）を認識することで知られる2つの酵素の中の1つです。

内容：

• Not I
• SuRE/CutバッファーH（10x）

認識サイト：GCGG*C*CG °C
GCGG*C*CG °C
制限サイト：GC↓GG*C*CG °C
GC↓GG*C*CG °C
熱失活：Not I は 65℃、15分のインキュベーションで熱失活します（100 U/μg DNAまで）。

各DNAの切断部位数

• λ：0
• φx174：0
• Ad2：7
• M13mp7：0
• pBR322：0
• pBR328：0
• pUC18：0
• SV40：0

生成フラグメントの平均サイズ
原核生物ゲノムDNA：Not I フラグメントのサイズ範囲：20～1,000 kb （GCの内容物に依存）。
酵母ゲノムDNA：Not I フラグメントの平均サイズ：200 kb。
哺乳類ゲノムDNA：Not I フラグメントサイズ：約1,000 kb。

適合する末端
Not I 末端は、Eae I およびEclX I (Xma III)によって生成された末端に適合します。

イソ制限酵素
本酵素には既知のイソ制限酵素ありません。

メチル化の感度
認識シーケンスに(*)で示す位置に5-メチルシトシンが存在するとNot I が阻害されます。しかし、5′-C位置 (°) に5-メチルシトシンが存在しても阻害は起こりません。

完全PCRミックス中の相対活性
PCRミックス（Taq DNAポリメラーゼバッファー）中の相対活性は0%です。このPCRミックスにはλDNA、プライマー、10 mM Tris-HCl（pH 8.3、+20°C）、50 mM KCl、1.5 mM MgCl₂、200 μM dNTPs、2.5 U Taq DNAポリメラーゼが含まれていました。このミックスを使って25回の増幅サイクルを実施しました。PCRミックスのRE消化物に100 mM NaClを添加した後も、Not Iの活性は非常に低い（< 5%）ままでした。

インキュベーション温度
+37°C

PFGE試験済み
Not Iはパルスフィールドゲル電気泳動で試験されています（細菌染色体）。PFGE解析用にアガロースに包埋されたゲノムDNA（E. coli C 600）を切断するときは、10 Uの酵素/μg DNAの使用と4時間のインキュベーションを推奨します。

ライゲーションと再切断アッセイ
1 μg Ad2 DNAの完全消化により得られたNot I フラグメントを、10 μlの量で1 U T4 DNAリガーゼを使って66 mM Tris-HCl、5 mM MgCl₂、5 mMジチオスレイトール、1 mM ATP（pH 7.5、+20°C）中で+4°Cで16時間ライゲーションすると、Ad2 DNAの回収率は>80%となります。
これに続いて、Not Iを用いて再度切断すると、収率>90%でAd2 × Not I フラグメントの典型パターンが得られます。

SuRE/Cutバッファーシステム
最適活性を得るためには太字で示したバッファーの使用をお薦めします

• A: 10-25%
• B: 50-75%
• H: 100%
• L: 0-10%
• M: 25-50%

非特異的エンドヌクレアーゼ活性なし。
1μG のAd2 DNAを 50μl のSuRE/CutバッファーHに入れ、過剰量のNot I の存在下で１６時間インキュベートします。酵素に固有なパターンを変化させない酵素ユニット数が分析証明書に明記されています。

エキソヌクレアーゼ活性なし
約5 μg [³H]標識ウシ胸腺DNAは、全量100 μlの50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂、1 mM Dithioerythritol（pH約7.5）中で3 μl Not１と共に+37°Cで4時間インキュベートします。これらの条件下では、分析証明書に記載されているとおり、放射能の放出は検出されません。

PCRバッファー中の活性：0%

生命科学研究専用です。診断手順には使用しません。

１ユニットは、全量25 μl の(1x) のSuRE/CutバッファーHの中で、+37 °Cの温度において１時間で 1 μg Ad2DNAを切断できる酵素活性を意味します。この処理により以下の8種類のフラグメントが得られます：18629、6493、5001、2594、1931、954、326（長さ 9 bp）。Ad2 DNA が持つ切断サイトの中の１つは、他の6個所よりも切断がはるかに緩慢に進みます。