[コンテンツへスキップ](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [![Merck](https://www.sigmaaldrich.com/static/logos/purple/merck.svg)](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja) 製品カート0 JPJA 製品 [ログイン / 登録](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [注文検索](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/order-lookup) [クイックオーダー](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/quick-order) カート0 [ホーム](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja)[ポリメラーゼ連鎖反応のアプリケーション](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/applications/genomics/pcr)標準PCRプロトコル # 標準PCRプロトコル ## PCRの方法標準的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のセットアップは以下の4つのステップで構成されています: 1. 必要な試薬またはマスターミックスとテンプレートをPCRチューブに加える。 \*加熱蓋のないサーマルサイクラーでは、蒸発を防ぐためにミネラルオイルを加えます。 2. サーマルサイクラーとプライマーのパラメーターに従って増幅します。 3. アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウム染色によって増幅DNAを評価します。 ![PCRチューブはPCRの増幅ステップのためにサーマルサイクラーにセットされる。](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/protocols/genomics/pcr/loading_pcr_tubes_into_thermocycler.jpg "Loading PCR tubes into thermocycler") これらの手順を、材料と試薬選択のヒントとともに、より詳細に以下に示す。これはTaq DNAポリメラーゼを用いた基本的なPCRプロトコールである。 ## PCR Steps and Essential PCR Components PCR反応のトラブルシューティングには多くの要素が含まれます。このアニメーションを見ながら、ニーズに合ったコンポーネントとサイクリング条件を選択することで、どのように最適な結果を得ることができるかを学びましょう。 * * * [プロトコル](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/pcr-technologies-protocols-introduction)のPCR技術ガイドのセクションで、他のポリメラーゼや高度なPCR技術に関する追加のプロトコルを見つけてください。標準的なPCRについては、[PCR Basics page](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/routine-amplification). ## [](https://www.sigmaaldrich.com)試薬：PCRには何が必要ですか？ PCRで使用する試薬推奨製品 *Taq*DNA polymeraseユーザーの好みに応じて選択してください。(下記の[*Taq* ポリメラーゼの表](https://www.sigmaaldrich.com#taqdnapolymerase) を参照してください。) PCR grade waterPCR試薬水作業濃度まで希釈したプライマー 10μMの作業ストックはほとんどのアッセイに十分です。オリゴ[カスタムオリゴ](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/products/molecular-biology-and-functional-genomics/oligos-and-qpcr-probes/custom-predesigned-dna-oligos-and-qpcr-probes) 増幅されるDNA DNA-oligos-and-qpcr-probes.研究者より提供専用ピペットサーマルサイクラー様々なウェルブロックサイズまたはマルチフォーマット滅菌済みフィルターピペット 1.5 mL スクリュートップ微量遠心チューブコーニング® スクリューキャップ付き微量遠心チューブ滅菌済み1. PCRチューブまたはプレートサイクラーに合わせてお選びください： Individual thin-walled 200 µL PCR tubes 200 µLストリップチューブ；マルチウェルプレートとプレートシール dNTP mixDeoxynucleotide mix ；containing 10 mM each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP \*readymixes already include dNTPs ## *Taq* ポリメラーゼとは何ですか？ *Taq* DNA ポリメラーゼは、好熱性細菌である*Thermus aquaticusに由来する耐熱性酵素です。* は一般にPCRでDNA断片を増幅するのに用いられる。この酵素は組換え型で、*大腸菌*で発現する。この酵素は、（PCR法で要求される）95℃への繰り返しの加熱にも、活性を著しく失うことなく耐えることができる。酵素の分子量はSDS-PAGEで約94kDaで、エンドヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼ活性は検出されない。5'→3'DNAポリメラーゼ活性と5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有する。各ロットの*Taq* DNA Polymeraseは、PCR増幅および二本鎖シーケンシング用に試験されています。酵素は5 ユニット/µLで供給され、最適化された10x反応バッファーが付属しています。 [](https://www.sigmaaldrich.com) ### Standard *Taq <*DNA ポリメラーゼ下の表を参考に、反応条件に適した*Taq DNAポリメラーゼを選択してください。塩化マグネシウム(MgCl2)の有無にかかわらず、透明または赤色に染色された製剤、またはバッファーとdNTPsを含む調製済みのレディミックスまたはマスターミックスからお選びください。* MgCl2を含む＆。 MgCl2を分離レディミックス染料無添加のクリアタイプゲルに直接塗布する赤色染料入り染料無添加のクリアタイプ<ゲルに直接ロードするための赤色染料付き染料なしのクリア製剤 *Taq* DNA Polymerase from&?(D1806)RED*Taq*® >DNA ポリメラーゼ (D4309)*Taq DNA ポリメラーゼ*RED*Taq*® > ReadyMix™ ；PCR Reaction Mix (R2523)ReadyMix™ *Taq* PCRリアクションミックス (P4600) __単位定義：__1単位は、74℃で30分間で、10nmolの全デオキシリボヌクレオシド三リン酸を酸沈殿性DNAに組み込みます。 ## [](https://www.sigmaaldrich.com)手順：PCR のステップ *Taq* DNAポリメラーゼ、鋳型DNA、プライマー、MgCl2の濃度の最適条件は、利用するシステムによって異なる。各成分の最適条件を決定する必要があるかもしれない。これは特に*Taq*DNAポリメラーゼ、サイクリングパラメーター、MgCl2濃度に当てはまる。 1. __試薬を適切な大きさのチューブに、表の順序で加える。(反応のセットアップに適切な表を選択する。標準試薬またはレディミックス試薬。) 多数の反応を行う場合は、テンプレートを含まないマスターミックスをセットアップし、反応チューブに分注する。最後にテンプレートを適切なチューブに加える。__ 分量成分最終濃度 w µL水 5 µL10x PCR Buffer ([P2192](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/product/sigma/P2192) ；または[P2317](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/product/sigma/P2317))\*1倍 10x PCR Buffer ([P2192](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/product/sigma/P2192) )tr> 1μLデオキシヌクレオチドミックス200 µM w µL順方向プライマー（通常15-30塩基長）0.1-0.5 µM x µL 0.valign="top">逆プライマー（通常15-30塩基長） 0.1-0.5 µM 0.5 µL *Taq* DNA Polymerase* 0.05 units/µL y µL 200 pg/µL z µL 25 mM MgCl2 0.1-0.5 mM __50 µL__ __総反応量__ \*バッファーと*Taqポリメラーゼを一緒に購入してください： D1806, D4309 または D4545* ### レディミックスPCR反応分量成分最終濃度 25 µL Readymix ([R2523](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/product/sigma/R2523) or ；[P4600](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/product/sigma/P4600)) w µL フォワードプライマー（通常15-30塩基長） 0.1-0.5 µM x µL 0.valign="top">逆プライマー（通常15-30塩基長） 0.1-0.5 µM y µ?L 鋳型DNA（通常10 ng）鋳型DNA（通常10 ngbr> 200 pg/µL z µL 水 __50μL__ __総反応量__ 2\. __ボルテックスで穏やかに混合し、短時間遠心__して全成分をチューブの底に集める。注意：加熱蓋のないサーマルサイクラーを使用する場合は、蒸発を防ぐために各チューブの上部に50μLのミネラルオイルを加える。 3\. __増幅__ 増幅パラメーターは、使用するプライマーやサーマルサイクラーによって異なります。 ### 典型的なサイクルパラメーター 25～30サイクルの増幅を推奨します。 | | | | | |------------|----------------|----------|----| | PCR Step | Temperature °C | Duration | | | 変性テンプレート | | 94 °C | 1分 | | プライマーのアニール | 1 分 | | | | 1 分 | 2分 | | | | アニール | エクステンション | 72 °C | 3分 | 4.増幅されたDNAは、[agarose gel electrophoresis](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/protocol/genomics/nucleic-acid-gel-electrophoresis/nucleic-acid-electrophoresis) and subsequent ethidium bromide staining. Note: Mineral oil overlay may be removed by a single chloroform extraction (1:1), recovering the aqueous phase. ### [](https://www.sigmaaldrich.com) - アガロース - （プレキャストゲル、パウダーなど。 - MOPS-EDTA-酢酸ナトリウム、トリス-酢酸-EDTA（TAE）、トリス-ホウ酸-EDTA（TBE）などのバッファー - ゲルローディング液、サンプルローディングバッファー。ゲルローディング溶液およびRNA用サンプルローディングバッファー - 電気泳動染色剤または色素（臭化エチジウムなど） 1\. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. [https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695](https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695) 2\. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. [https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371](https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371) 3\. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press. 4\. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press. 5\. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. [https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436](https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436) 6\. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell. 7\. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. [https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989](https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989) 8\. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. [https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775](https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775) 9\. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press. 10\. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 11\. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. [https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465](https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465) 12\. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. [https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266](https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266) ## レーベルライセンスステートメント ### 購入者への注意事項：DISCLAIMER OF LICENSE No license is conveyed with the purchase of this product under any of US Patents Nos.5,804,375、5,994,056、6,171,785、6,214,979、5,538,848、5,723,591、5,876,930、6,030,787、および6,258,569、ならびに米国外の対応する特許、または5'ヌクレアーゼおよびdsDNA結合色素プロセスに関するその他の特許または特許出願に基づくライセンスは、本製品の購入により譲渡されるものではありません。詳細については、Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USAのDirector of Licensingまでお問い合わせください。 ## 材料申し訳ございませんが、想定外のエラーが発生しました。 Response not successful: Received status code 500 __関連記事__ - [Milli-Q®SQ *2シリーズ*超純水製造装置](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/wet-chemical-analysis/installation-use-of-milli-q-2series-water-purification-system) - [オリゴヌクレオチドのアニーリングプロトコル](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/protocol/genomics/pcr/annealing-oligos) - [DNase Iリコンビナント、RNaseフリープロトコル](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/protocol/genomics/pcr/dnase-i-recombinant-rnase-free) - [Expand™ Long Template PCR Systemプロトコルのトラブルシューティング](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/protocol/genomics/pcr/expand-long-template-pcr-system) - [First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR（AMV）を使用したRNAの取り扱い方](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/protocol/genomics/pcr/first-strand-cdna-synthesis-kit-for-rt-pcr-amv) - [Kapa Biosystems社のTaq DNAポリメラーゼ・PCRキット](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/protocol/genomics/pcr/kapa-pcr-kits) - [オリゴヌクレオチドの融解温度](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/protocol/genomics/pcr/oligos-melting-temp) - [標準的な逆転写プロトコル](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/protocol/genomics/pcr/standard-reverse-transcription-protocol-two-step) - [もっと見る](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) __関連製品カテゴリー__ - [シーリングフィルム・ホイル・テープ](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/products/labware/sealing-films-foils-and-tapes) - [大気汚染物質（アルデヒドおよびケトン）の迅速かつ信頼性の高いGC/MS測定法](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/calibration-qualification-and-validation/fast-and-reliable) - [ネオニコチノイド類](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/calibration-qualification-and-validation/neonicotinoids-bee-pesticides) - [生薬製品向け品質管理用標準物質における定量NMR](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/calibration-qualification-and-validation/quantitative-nmr-used) - [Millicup™-FLEXディスポーザブル吸引ろ過ユニットとデモビデオ](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/filtration/millicup--flex-disposable-vacuum-filtration-units-and-demo-video) - [Samplicity® G2フィルトレーションシステム](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/filtration/samplicity-in-hplc) - [イオン液体GCカラム](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/gas-chromatography/ionic-liquid-gc-capillary-columns) - [個々のメソッドに適したGCカラムの選択](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/gas-chromatography/select-proper-method-specific-gc) - [もっと見る](https://www.sigmaaldrich.com/JP/ja/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) TOP __ログインして続行__ 続きを確認するには、ログインするか、新規登録が必要です。ログイン__アカウントをお持ちではありませんか？__お客様情報を登録 An unknown error has occured.