Mappe dei vettori
Il team di ricerca e sviluppo MISSION, in collaborazione con gli scienziati del progetto The RNAi Consortium (TRC), ha generato librerie di vettori che contribuiranno a una messa a punto ottimale dei vostri esperimenti di RNAi. Il vettore base pLKO.1-puro è stato sviluppato presso il Broad Institute nell’ambito del progetto TRC. Il nostro contributo al TRC consiste in librerie diversificate di vettori per esperimenti critici di controllo, oltre a vettori per la produzione di shRNA personalizzati. In questa pagina sono riportate informazioni relative a tali vettori.
Sequenza di pLKO.1-puro (senza inserto di shRNA)
Vettore della libreria TRC1.5: pLKO.1-puro
Vettori di controllo per la libreria TRC1.5
Strutture di base alternative per il vettore della libreria TRC1.5
Vettore della libreria TRC2: TRC2-pLKO-puro
Vettori di shRNA inducibili
Vettori per il packaging di lentivirus
Bibliografia
Vettore della libreria TRC1.5: vettore pLKO.1-puro e suo uso
I cloni della libreria TRC1.5 sono inseriti esattamente nella stessa struttura di base del vettore dei cloni della libreria TRC1
Le caratteristiche del vettore pLKO.1-puro consentono sia la transfezione transiente o stabile di shRNA sia la produzione di particelle lentivirali.1 La selezione per ottenere stabilmente il silenziamento genico avviene grazie al marcatore selezionabile puromicina, mentre la produzione delle particelle virali SIN (auto-inattivanti), incompetenti per la replicazione, è ottenibile all’interno delle cellule di packaging (HEK293T) co-transfettando plasmidi packaging-compatibili.2,3 Esclusiva del nostro catalogo, la libreria TRC1.5 contiene circa 200.000 cloni, di cui oltre 49.000 validati. Oltre a tutto il contenuto della libreria TRC1, questa libreria contiene anche altri 39.212 cloni mirati a 2.661 nuovi geni umani e a 2.395 geni murini. A differenza dei sistemi adenovirali o retrovirali murini basati su MMLV o MSCV, le particelle basate su lentivirus sono efficienti nell’infezione e nell’integrazione dello specifico costrutto di shRNA in cellule differenziate e non in divisione attiva, come i neuroni e le cellule dendritiche, superando i problemi di bassa efficienza di transfezione e integrazione incontrati con questi tipi cellulari. Rispetto agli siRNA e ad altri sistemi basati su vettore, il plasmide pLKO.1-puro rappresenta una soluzione per il knock-down a lungo termine, per l’osservazione fenotipica e per la trasduzione in linee cellulari difficili o sensibili (cellule non in divisione attiva o cellule primarie), oltre a essere un’economica risorsa rinnovabile.
Con l’aggiunta di un inserto di shRNA, la lunghezza del plasmide pLKO.1-puro è di 7.086 bp, come indicato nella mappa del vettore sotto riportata. Senza inserto di shRNA, pLKO.1-puro è lungo 7.052 bp. Il file della sequenza allegato è relativo al vettore pLKO.1-puro vuoto (7.052 bp).
Descrizione e caratteristiche del vettore TRC1.5
Strutture di base alternative del vettore TRC1.5
La nostra offerta standard di shRNA comprende anche svariate strutture di base alternative per il vettore. Grazie alla piattaforma MISSION, è possibile ordinare shRNA TRC personalizzati all’interno della struttura di base di questo vettore direttamente online, alle pagine dei singoli cloni, sia nel formato di DNA plasmidico che di particelle di trasduzione di tipo lentivirale. Per dettagli su come ordinare strutture hairpin personalizzate, visitate la nostra pagina dei cloni personalizzati.
Mettiamo a disposizione anche molte altre strutture di base alternative per il vettore contenenti proteine fluorescenti o il promotore di UbC. Questi costrutti sono disponibili solo come opzioni su misura. Per dettagli su come ordinare, visitate la nostra pagina dei cloni personalizzati.
Vettore della libreria TRC2: vettore TRC2-pLKO-puro e suo uso
Anche il vettore TRC2-pLKO-puro permette sia la transfezione transiente o stabile di shRNA sia la produzione delle particelle lentivirali. L’unica differenza tra il vettore TRC1.5 e il vettore TRC2 è l’aggiunta di WPRE (Woodchuck Hepatitis Post-Transcriptional Regulatory Element),4 che amplifica l’espressione dei transgeni trasdotti da lentivirus.5 Come nel caso di TRC1.5, il silenziamento genico stabile si ottiene grazie al marcatore selezionabile puromicina. La produzione delle particelle virali SIN (auto-inattivanti), incompetenti per la replicazione, è ottenibile all’interno delle cellule di packaging (HEK293T) co-transfettando plasmidi packaging-compatibili. TRC2-pLKO-puro rappresenta una soluzione per un knock-down stabile a lungo termine, per l’osservazione fenotipica, per la trasduzione in linee cellulari difficili o sensibili (cellule non in divisione attiva o cellule primarie) e per amplificare l’espressione dei transgeni.
Con l’aggiunta di un inserto di shRNA, la lunghezza del plasmide TRC2-pLKO-puro è di 7.518 bp, come indicato nella mappa del vettore sotto riportata. Senza inserto di shRNA, TRC2-pLKO-puro è lungo 7.484 bp. Il file della sequenza allegato è relativo al vettore TRC2-pLKO-puro vuoto (7.484 bp).
Sequenza di TRC2-pLKO-puro (senza inserto di shRNA)
Mappa del vettore della libreria TRC2 (TRC2-pLKO-puro)
NB: al momento non sono disponibili strutture di base alternative per il vettore della libreria TRC2.
Vettori di shRNA inducibili
Il vettore pLKO è stato ridisegnato aggiungendo un repressore (LacI) e un operatore (LacO) nel promotore U6 dell’espressione dell’shRNA umano modificato. In assenza di IPTG (isopropil-β-D-tio-galattoside), un analogo del lattosio, LacI si lega a LacO impedendo l’espressione dell’shRNA. In presenza di IPTG, il repressore allosterico LacI cambia conformazione e si stacca dal promotore U6 umano modificato contenente LacO, consentendo così l’espressione dell’shRNA.
Siamo fieri di potervi offrire due diversi vettori inducibili da IPTG per la vostra ricerca. Il vettore inducibile preferito, pLKO-puro-IPTG-3xLacO, contiene tre sequenze dell’operone lac (due nel promotore U6 e una nel 3' del promotore), che lo rendono finemente regolabile e che permettono di ottenere un forte silenziamento genico. Il vettore pLKO-puro-IPTG-1xLacO contiene una sola sequenza dell’operone lac nel promotore U6, che da una parte favorisce l’espressione dell’shRNA, ma dall’altra allenta il controllo sul promotore quando non è indotto.
Bibliografia
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