Protocole PCR standard

Comment faire une PCR

Une réaction en chaîne par polymérase (PCR) standard comprend quatre étapes:

1. Ajouter les réactifs requis ou le mastermix et le modèle aux tubes PCR.
2. Mélanger et centrifuger.
   *Ajouter de l'huile minérale pour éviter l'évaporation dans un thermocycleur sans couvercle chauffant.
3. Amplifier selon les paramètres du thermocycleur et des amorces.
4. Évaluer l'ADN amplifié par électrophorèse sur gel d'agarose suivie d'une coloration au bromure d'éthidium.

Ces étapes sont présentées ci-dessous de manière plus détaillée, avec des conseils sur le matériel et la sélection des réactifs. Il s'agit d'un protocole PCR de base utilisant l'ADN polymérase Taq.

Étapes de la PCR et composants essentiels de la PCR

Le dépannage d'une réaction PCR implique de nombreux facteurs. Regardez cette animation pour apprendre comment la sélection des composants et des conditions de cyclage adaptés à vos besoins peut vous aider à obtenir des résultats optimaux.

Trouvez des protocoles supplémentaires pour d'autres polymérases ou des techniques PCR avancées dans la section Protocoles de notre Guide des technologies PCR.

Pour en savoir plus sur la PCR standard, y compris ce qu'elle est, consultez notre Bases de la PCR.

Réactifs : Qu'est-ce qui est nécessaire pour la PCR ?

Réactif utilisé dans la PCR	Produit recommandé
Taq ADN polymérase	Sélectionnez Taq l'ADN polymérase en fonction des préférences de l'utilisateur. (Voir le tableau séparé Taq polymerase ci-dessous.)
Eau de qualité PCR	Eau de réactif PCR
Primers dilués à la concentration de travail	Des stocks de travail de 10 µM sont suffisants pour la plupart des essais.
Oligos	Oligos personnalisés
ADN à amplifier	Il est fourni par le chercheur	.Fourni par le chercheur
Pipettes dédiées
Thermocycleur	Avec différentes tailles de blocs de puits ou en multiformat
Pipettes stériles à filtre
	Microcentrifuge stérile de 1.Tubes à microcentrifugation de 5 mL à bouchon à vis	Corning® tubes à microcentrifugation à bouchon à vis
Tubes ou plaques pour PCR	Choisir en fonction du cycleur :
	Tubes PCR individuels de 200 µL à paroi fine
	Tubes à bandelettes de 200 µL
dNTP mix	Mélange de désoxynucléotides  ;contenant 10 mM de dATP, dCTP, dGTP, et dTTP *readymixes incluent déjà des dNTP

Qu'est-ce que Taq Polymérase ?

Taq ADN polymérase est une enzyme thermostable dérivée de la bactérie thermophile Thermus aquaticus. Elle est couramment utilisée pour amplifier des fragments d'ADN dans la PCR. L'enzyme se présente sous une forme recombinante, exprimée dans E. coli. Elle est capable de résister à des chauffages répétés à 95 °C (comme l'exige la technique PCR) sans perte significative d'activité. L'enzyme a un poids moléculaire d'environ 94 kDa par SDS-PAGE, sans activité endonucléasique ou exonucléasique détectable. Elle a une activité 5'→3' ADN polymérase et 5'→3' exonucléase. Chaque lot de Taq ADN polymérase est testé pour l'amplification PCR et le séquençage double brin. L'enzyme est fournie à 5 unités/µL et est accompagnée d'un tampon de réaction 10x optimisé.

Standard Taq L'enzyme est testée pour l'amplification PCR et le séquençage double brin.

Utilisez le tableau ci-dessous pour sélectionner un mélange de Taq ADN polymérase adapté à vos conditions de réaction. Choisissez parmi les formulations claires ou teintées en rouge avec ou sans chlorure de magnésium (MgCl₂) ou un readymix ou master mix préparé à l'avance avec tampon et dNTPs.

Contenant MgCl2   ;   ;   ;   ;   ;		Séparer MgCl2	Readymix   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; &...nbsp ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;
Formulation claire sans colorant	Avec colorant rouge pour chargement direct sur gels	Formulation claire sans colorant	Avec colorant rouge pour chargement direct sur gels	Formulation claire sans colorant
Taq DNA Polymérase de  Thermus aquaticus (D1806)	REDTaq® ADN polymérase (D4309)	Taq ADN polymérase de (D4309)	Taq ADN polymérase deTaq ADN polymérase de Thermus aquaticus, sans MgCl2 (D4545)	REDTaq® ReadyMix™  ;PCR Reaction Mix (R2523)	ReadyMix™ Taq PCR Reaction Mix (P4600)

Définition de l'unité: Une unité incorpore 10 nmol de désoxyribonucléosides triphosphates totaux dans l'ADN précipitable à l'acide en 30 minutes à 74 °C.

Procédure : Étapes de la PCR

Les conditions optimales pour la concentration de l'ADN polymérase Taq, de l'ADN matrice, des amorces et du MgCl₂ dépendent du système utilisé. Il peut être nécessaire de déterminer les conditions optimales pour chaque composant individuel. Ceci est particulièrement vrai pour l'ADN polymérase Taq, les paramètres du cycle et la concentration de MgCl₂. Il est recommandé de titrer l'enzyme et le MgCl₂ pour déterminer l'efficacité optimale.

1. Ajouter les réactifs à un tube de taille appropriée dans l'ordre indiqué dans le tableau. (Pour un grand nombre de réactions, un mélange maître sans le modèle doit être préparé et aliquoté dans les tubes de réaction. A la fin, le modèle doit être ajouté aux tubes appropriés.
   

Réaction PCR standard

Montant	Composant	Concentration finale
w µL	EauEau
5 µL	10x PCR Buffer (P2192  ;ou P2317)*	1x
1 µL	Mélange de désoxynucléotides	200 µM
w µL	Amorceur de progression (typiquement 15-30 bases de longueur)	0.1-0.5 µM
x µL	Amorceur inverse (typiquement 15-30 bases de longueur)	0.1-0.5 µM
0.5 µL	Taq ADN polymérase*	0.05 unités/µL
y µL	ADN modèle (typiquement 10 ng)	200 pg/µL
z µL	25 mM MgCl2  ;(utiliser seulement avec le tampon P2317)	0.1-0.5 mM
50 µL	Volume total de la réaction

*Acheter le tampon et Taq polymérase ensemble: D1806, D4309 ou D4545

Réaction PCR Readymix

Montant	Composant	Concentration finale
25 µL	Readymix (R2523 ou  ;P4600)
w µL	Amorceur direct (généralement d'une longueur de 15 à 30 bases)	0.1-0.5 µM
x µL	Amorceur inverse (généralement d'une longueur de 15 à 30 bases)	0.1-0.5 µM
y µL	ADN modèle (typiquement 10 ng)	ADN modèle (typiquement 10 ng)br>	200 pg/µL
z µL	Eau
50 µL	Volume total de la réaction

2. Mélanger doucement au vortex et centrifuger brièvement pour recueillir tous les composants au fond du tube.

Note : Ajouter 50 µl d'huile minérale au sommet de chaque tube pour empêcher l'évaporation si vous utilisez un thermocycleur sans couvercle chauffant.

3. Amplifier. Les paramètres d'amplification varieront en fonction des amorces et du thermocycleur utilisé. Il peut être nécessaire d'optimiser le système pour des amorces, des modèles et des thermocycleurs individuels.

Paramètres de cyclage typiques

25-30 cycles d'amplification sont recommandés.

Les paramètres d'amplification varient en fonction des amorces et des thermocycleurs utilisés.

Étape de la PCR	Température °C	Durée
Modèle de température	94 °C	1 min
Annéalisez les amorces	55 °C	2 min
Extension	72 °C<	2 minbr>	3 min

électrophorèse sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium.

  ;   ;   ; Note : la couche d'huile minérale peut être éliminée par une seule extraction au chloroforme (1:1), en récupérant la phase aqueuse.

Réactifs pour l'électrophorèse des acides nucléiques

• Agarose  ;(gels préfabriqués, poudre, etc.)
• Tampon tel que MOPS-EDTA-acétate de sodium, tris-acétate-EDTA (TAE) ou tris-borate-EDTA (TBE)
• Tampon tel que MOPS-EDTA-acétate de sodium, tris-acétate-EDTA (TAE) ou tris-borate-EDTA (TBE).Solution de chargement du gel et tampon de chargement de l'échantillon pour l'ARN
• Tache ou colorant d'électrophorèse tel que le bromure d'éthidium

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Matériaux

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