酶活性测定

酶活性测定原理

研究人员主要采用酶活性测定方法鉴定生物体、组织或样品中有无特定酶或测定酶含量。此类酶包括α-淀粉酶、过氧化氢酶、漆酶、过氧化物酶、溶菌酶和报告酶碱性磷酸酶和萤光素酶。目前可选择多种试剂和方法广泛研究特定酶-底物相互作用。工作流程解决方案选择主要取决于研究人员所需的灵敏度。比色法可检测有无酶,荧光试剂则更适合定量酶活性。

确定维持酶活性的最佳条件

尽管文献中记载了多种酶测定方法,但仍有必要根据不同要求酌情调整。酶的比活性取决于多种因素,包括pH、温度、离子强度和测定体系各组分浓度。酶活性曲线通常会随pH等条件变化呈钟形。最适pH值下的最高活性采用Vmax表示,而曲线两端的活性较低。某些酶可能还需考虑到不直接参与反应的化合物,如金属离子、去垢剂和疏水分子。


相关技术文章

相关实验方案


酶活性测定组分

对于许多酶而言,水是标准溶剂,毕竟它与细胞中的水环境相同。但在某些酶或酶组分不溶于水时,也会用到有机溶剂。此外,底物和辅因子、酶促反应催化剂也是酶活性测定体系的关键组分。底物和辅因子通常基于生理条件下的功能确定。因此,底物和辅因子会广泛相互作用,并可能为多种酶所需要。缓冲液和离子是需要考虑的另一关键要素——它们是维持整个测定体系pH稳定的必要条件,并直接影响酶的活性。例如,单价或二价金属离子可能是维持反应物内的辅因子催化活性及酶活性的必要成分。

进行酶活性测定

酶活性测定组分制备是实际起始步骤。通常最好制备大量缺失一种活化组分外的测定体积混合物,以避免在进行小体积移液时固有的移液误差造成影响。完成测定混合物制备后,研究人员便可将最终的活化组分加入混合物,启动活性测定。在测定开始前,低温储存并利用化学或蛋白质添加剂等常规手段预处理酶,是确保酶稳定性和最大活性的关键因素。反应材料加入到观察容器中后,应在反应开始时快速、彻底混匀所有的组分。混匀后应立即开始记录数据,并基于测定反应完整时程的检出信号绘图。