硫醇修饰寡核苷酸DDT还原方案

还原二硫键

本方案将巯基修饰的寡核苷酸的二硫键还原为活性巯基形式（图1）。巯基可用于将寡核苷酸附着在固体表面，如金纳米颗粒。利用二硫苏糖醇（DTT，也称为Cleland试剂）还原二硫键，也可防止引物二聚体形成。

耗材

• 2 mL 离心管
• 移液器吸头
• Milli-Q^® H₂O
• DTT (D9779)
• NAP™-10柱 (GE17-0854-01）
• 磷酸钠缓冲液
• 硫醇修饰的寡核苷酸

方法

该方法分为两个步骤：1）巯基形成，和2）副产物去除。

硫醇形成

1. 制备溶于100mM磷酸钠缓冲液中的100mM DTT溶液，pH 8.3 - 8.5。如需制备5mL，在缓冲液中溶解77.13mg DTT。
2. 若达到12.5 OD（光密度单位；若> 12.5 OD，保持DTT溶液比寡核苷酸OD比例为10:1），将硫醇修饰的寡核苷酸溶解于125µL的DTT溶液中。
3. 在室温下孵育1小时。

副产物去除

1. 用大约15mL的100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)平衡NAP-10柱。等待平衡缓冲液完全进入柱床。
2. 将1.0 mL的反应混合物加入NAP-10柱中(用磷酸钠缓冲液补足反应混合液的体积至1.0 mL，按需要调pH至6.0)。让反应混合物完全进入柱床。
3. 将巯基修饰的寡核苷酸洗脱到离心管中，加入1.0 mL pH 6.0的磷酸钠缓冲液。

其他说明

根据实验室标准操作方法，分别制备pH 8.3 - 8.5和6.0的磷酸钠缓冲液。所有缓冲液均采用Milli-Q^®纯水配制。