Protokół badania przepuszczalności in vitro z użyciem membran Strat-M^®

Większość środków farmaceutycznych i kosmetycznych dostępnych obecnie na rynku jest dostarczana przezskórnie lub miejscowo drogą biernej dyfuzji. Membrany Strat-M^® zostały opracowane w celu naśladowania tego pasywnego procesu dyfuzji. Ta syntetyczna membrana została zaprojektowana w celu zapewnienia modelu niezwierzęcego do przezskórnej dyfuzji i testowania bezpieczeństwa substancji czynnych kosmetyków, preparatów, produktów higieny osobistej, aktywnych składników farmaceutycznych (API) oraz pestycydów i chemikaliów. Opracowaliśmy protokół testowania dyfuzji preparatów kofeiny przy użyciu membran Strat-M^®. Protokół ten może być wykorzystany jako podstawa do testowania dyfuzji innych związków przy użyciu membran Strat-M^®.

Testowanie dyfuzji przezskórnej preparatów zawierających kofeinę

Procedura

1. Konfiguracja początkowa

1. Włącz łaźnie z cyrkulującą wodą.
2. Filtruj próżniowo 500 ml buforu PBS przez filtrację próżniową i utrzymuj pod próżnią przez co najmniej 30 minut.
3. Odczekaj 30 minut, aż łaźnie wodne osiągną temperaturę (37 °C).
4. Upewnij się, że mieszanie jest włączone dla obu stref w urządzeniu Logan, włączając przełącznik mieszania z przodu urządzenia Logan.
5. Umieść 25 mm membranę Strat-M^® między komorą dawcy i komorą odbiorcy i zaciśnij je razem.
6. Upewnij się, że błyszcząca strona (skóra) membrany jest skierowana w stronę komory dawcy (góra).
7. Napełnij komorę receptora PBS, przelewając przez boczne rurki, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Platformę komory receptora można przechylić, aby upewnić się, że w komorze nie ma pęcherzyków powietrza.
8. Podłącz strzykawki 5 ml wypełnione PBS do portów pobierania próbek. W przypadku konkretnej komory receptora ta sama strzykawka o pojemności 5 ml jest używana podczas całego eksperymentu.
9. Odczekaj co najmniej 30 minut, aż PBS w komorze receptora osiągnie temperaturę 37°C.
10. Upewnij się, że podczas oczekiwania na osiągnięcie temperatury 37°C nie powstają pęcherzyki powietrza. Dodaj bufor w razie potrzeby, jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza.
11. Dodaj 500 µL preparatu do komory dawcy za pomocą pipetora lub odpowiedniego urządzenia. Zanotuj czas.

2. Przygotowanie preparatów

Roztwór kofeiny w glikolu propylenowym + kwas oleinowy

1. Najpierw przygotuj nasycony roztwór kofeiny w glikolu propylenowym, odważając 3 ± 0,1 g kofeiny do szklanej butelki o pojemności 200 ml. Dodać 150 ± 1 ml glikolu propylenowego (PG). Zakorkować butelkę i umieścić na młynku rolkowym na co najmniej 48 godzin w temperaturze pokojowej (19 - 25 °C).
2. Filtrować roztwór kofeiny w glikolu propylenowym przy użyciu bibuły filtracyjnej Whatman^® nr 1 i zespołu filtracji próżniowej.
3. Aby przygotować roztwór kofeiny w glikolu propylenowym + kwas oleinowy (OA), zmieszaj 95 ± 0,4 ml roztworu kofeiny w glikolu propylenowym z 5 ± 0.1 ml kwasu oleinowego w szklanej butelce o pojemności 200 ml i zakrętce.
4. Opisz butelkę z roztworem kofeiny datą przygotowania, nazwą operatora i datą.
5. Przechowywanie roztworu dawcy: 90 dni od daty przygotowania w temperaturze pokojowej (19-25 °C).

Roztwór receptora (sól fizjologiczna buforowana fosforanem, pH 7,4)

1. Rozpuścić 1 opakowanie soli PBS do 1000 ml przy użyciu wody Milli-Q^® . Do przygotowania tego roztworu używa się 1000 ml certyfikowanej kolby miarowej klasy A.
2. Opisz roztwór buforowy datą przygotowania, nazwą operatora i datą.
3. Przechowywanie roztworu buforowego: 7 dni od daty przygotowania w temperaturze pokojowej (19-25 °C)
4. Objętość roztworu receptora: 5,0 mL
5. Temperatura roztworu receptora: 37 °C ± 0,5 °C
6. Mieszanie: Stałe (300 obr./min ustawione fabrycznie)
7. Czas pobierania próbek: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 24, 26 godzin

3. Protokół pobierania próbek

1. Przed pobraniem każdej próbki sprawdź, czy nie tworzą się pęcherzyki powietrza.
2. W każdym punkcie czasowym pobierania próbki, usuń strzykawkę o pojemności 5 ml przymocowaną do indywidualnej komory i zastąp ją strzykawką o pojemności 3 ml.
3. Pobierz 1,0 ± 0.1 ml próbki z komory receptora i wyrzucić.
4. Podłącz strzykawki 3 ml do portu próbkowania i pobierz 500 ± 100 µL próbki do analizy. Ta sama strzykawka o pojemności 3 ml jest używana do pobierania próbek z pojedynczej komórki przez cały czas trwania eksperymentu.
5. Dodaj próbkę do płytki z głębokimi dołkami przy użyciu wstępnie zdefiniowanego układu.
6. Po pobraniu próbki oryginalne strzykawki o pojemności 5 ml są ponownie podłączane do odpowiednich portów, a roztwór receptora jest dodawany z powrotem do komory receptora, upewniając się, że nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza. Tę operację można wykonać, przechylając zestaw komórek Franza, aby zapewnić całkowite usunięcie pęcherzyków powietrza.

 

4. Przygotowanie roztworu kofeiny do HPLC (krzywa kalibracyjna)

1. Odważyć 50 ± 1 mg kofeiny za pomocą wagi analitycznej i przenieść do szklanej fiolki.
2. Odnotować rzeczywistą masę kofeiny w zapisie partii.
3. Dodaj 10 ml metanolu, aby sporządzić roztwór podstawowy kofeiny.
4. Aktualne stężenie roztworu podstawowego kofeiny [µg/mL = rzeczywista masa kofeiny (µg)
5. Aktualna objętość metanolu (mL)]
6. Opisz butelkę datą przygotowania, nazwą operatora i datą.
7. Ten roztwór podstawowy może być przechowywany w temperaturze 4 °C w lodówce przez 7 dni.
8. Rozcieńczyć roztwór podstawowy zgodnie z poniższym protokołem przy użyciu buforu PBS w celu przygotowania różnych wzorców roztworu kofeiny.
9. Na podstawie rzeczywistej masy zważonej kofeiny obliczane jest rzeczywiste stężenie wzorców i zapisywane w rejestrze partii. Po przygotowaniu wzorców, następujące wzorce są używane do generowania krzywej kalibracyjnej.

5. Analiza próbek metodą HPLC

Sprzęt i materiały eksploatacyjne