[Przejdź do zawartości](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl) Produkty Koszyk0 PLPL Produkty [Zaloguj się / Zarejestruj się](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [Wyszukiwanie zamówienia](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/order-lookup) [Szybkie zamówienie](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/quick-order) Koszyk0 [Strona główna](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl)[Ekspresja i wyciszanie genów](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/applications/genomics/gene-expression-and-silencing)Protokół spinokulacji # Protokół spinokulacji Biblioteki MISSION® TRC shRNA są kolekcjami wektorów shRNA opartych na lentiwirusach do stosowania w badaniach wyciszania genów. Niniejszy protokół opisuje wykorzystanie MISSION® TRC shRNA Lentiviral Particles w szczególności do długoterminowego wyciszania i obserwacji fenotypu w komórkach zawiesinowych. Poniższy protokół został opracowany na podstawie literatury1 do stosowania w 6-dołkowej płytce z MISSION® cząsteczkami lentiwirusowymi. System ExpressMag™ ([SHM01](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/SHM01) lub [SHM02](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/SHM02)) został również zoptymalizowany do transdukcji komórek zawiesinowych w czasie o 24 godziny krótszym niż ten protokół i w wielu formatach hodowli tkankowych. #### Przejdź bezpośrednio do - [Materiały](https://www.sigmaaldrich.com#material) - [Protokół](https://www.sigmaaldrich.com#protocol) - [Notatki](https://www.sigmaaldrich.com#notes) ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Materials #### MISSION® lentiviral particles Utilize [SHC002V](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/sch002v) lub [SHC001V](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/SHC001V) w celu optymalizacji protokołu transdukcji. Transdukcja [SHC003V](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/SHC003V) może być monitorowana za pomocą FACS lub mikroskopii fluorescencyjnej, ale protokoły do tego są poza zakresem tego dokumentu. Bardzo ważne jest, aby najpierw zoptymalizować protokół, aby mieć pewność co do wydajności transdukcji, co pozwoli oddzielić wpływ ładunku lentiwirusowego (shRNA lub niestandardowego ładunku) od wydajności transdukcji. Następnie, po przejściu na MISSION® lentiwirusa, który wyraża shRNA, wszelkie zmiany w wynikowej liczbie kolonii lub żywotnych komórek można przypisać efektom shRNA i nie można ich przypisać niskiej wydajności transdukcji. Po zoptymalizowaniu wydajności transdukcji, wykorzystaj cząsteczki MISSION® lentiwirusowe wyrażające shRNA ukierunkowane na interesujący cię gen lub wykorzystaj [custom MISSION® lentiwirusowa cząsteczka](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/custom-services) wyrażająca dowolny shRNA lub interesujący gen. __Puromycyna__  ([P9620](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/P9620)) 10 mg/ml roztwór podstawowy do selekcji<< __Pełna pożywka__ Dla komórek Jurkat DME zawierająca 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicę bydlęcą lub pożywkę dla danego typu komórek. __Błękit trypanu__ ([93595](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sial/93595)) .__12 x 15 mL stożków__ ([CLS430790](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/CLS430790)) __6-dołkowa płytka do hodowli tkanek__ ([CLS3516](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/CLS3516)) __Wirówka wahadłowa__ Wirówka powinna być wyposażona w regulację temperatury i wstępnie ogrzana do 32 ºC przed transdukcją komórek. __Hemacytometr__ ([Z359629](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/product/sigma/Z359629)) Hemacytometr służy do zliczania komórek. ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Protokół 01. Określ końcowe stężenie puromycyny, które ma być użyte w selekcji. Dokładne stężenie jest zależne od linii komórkowej i powinno być określone przez 72-godzinny test cytotoksyczności na nietransdukowanych komórkach. 02. Używaj tylko sterylnych przedmiotów i pracuj przy użyciu standardowych technik sterylności hodowli tkankowej podczas całej tej procedury. 03. Podgrzej wszystkie media do 37 °C. 04. Zlicz hodowane żywe komórki Jurkat. 05. Rozcieńczyć komórki Jurkat w pełnej pożywce do końcowego stężenia 1x105 komórek/mL o końcowej objętości 14 mL. 06. Przenieść 2 mL 1x105 komórek/mL do każdej z sześciu sterylnych probówek stożkowych o pojemności 15 mL. 07. Dodaj  MISSION® roztwór cząstek lentiwirusowych do komórek Jurkat w taki sposób, aby końcowa krotność infekcji (MOI) wynosiła 0, 0,1, 0,5, 1,0, 5,0 lub 10 na probówkę stożkową. Wartość 0 MOI reprezentuje nietransdukowaną kontrolę ujemną. 08. Wiruj komórki z prędkością 800 x *g* przez 30 minut w temperaturze 32 °C. 09. Podłoże zawierające wirusa jest odsysane i usuwane w odpowiedni sposób zgodnie z wymogami instytucji. 10. Każdy osad komórkowy jest ponownie zawieszany w 2 ml pożywki poprzez delikatne pipetowanie osadu w górę i w dół, a każdy ponownie zawieszony osad jest przenoszony do własnej studzienki w 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. 11. Płytka jest ponownie umieszczana w inkubatorze do hodowli tkankowej na trzy dni. 12. Po 3 dniach przenieś komórki do 6 oddzielnych 15 ml probówek stożkowych i osuszaj je z prędkością 200 x *g* przez 5 minut. Usunąć pożywkę i zastąpić 2 ml kompletnej pożywki zawierającej puromycynę. 13. Płytkę do hodowli tkankowej umieścić z powrotem w inkubatorze na noc. 14. Komórki są utrzymywane w puromycynie do momentu śmierci nietransdukowanych komórek kontroli ujemnej, co określa się na podstawie kontroli lub barwienia błękitem trypanu. #### Uwagi[](https://www.sigmaaldrich.com) Użyj poniższego równania do obliczenia MOI w studzience. Miano wirusa zostanie podane w certyfikacie analizy. VolumeofVirus to objętość w ml, która jest dodawana do studzienki/rurki wirówkowej zawierającej komórki do transdukcji. NumberofCells jest równa całkowitej liczbie żywych komórek w studzience/probówce wirówkowej. | | | | |-----|---|---------------------------------------------| | MOI | = | Miano wirusa (TU/mL) x Objętość wirusa (mL) | | | | Liczba komórek | . 1\. O'Doherty U, Swiggard WJ, Malim MH. 2000. Human Immunodeficiency Virus Type 1 Spinoculation Enhances Infection through Virus Binding. J. Virol.. 74(21):10074-10080. [https://doi.org/10.1128/jvi.74.21.10074-10080.2000](https://doi.org/10.1128/jvi.74.21.10074-10080.2000) __Powiązane protokoły__ - [Protokół odczynnika do transfekcji siRNA X-tremeGENE™ i rozwiązywanie problemów](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/transfection-and-gene-editing/x-tremegene-sirna-transfection-reagent) - [Edycja genomu za pomocą nukleazy RNA CRISPR Cas 9](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/advanced-gene-editing/crispr-cas9-genome-editing) - [Edycja genomu roślin za pomocą CRISPR/Cas9](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/advanced-gene-editing/genome-editing-in-plants-with-crispr-cas9) - [Protokół transdukcji lentiwirusowej](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/advanced-gene-editing/lentiviral-transduction) - [Biodegradowalne nanocząsteczki](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/gene-expression-and-silencing/biodegradable-nanoparticles) - [Escort™ IV Transfection Reagent Protocol](https://www.sigmaaldrich.com/PL/en/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/transfection-and-gene-editing/escort-4-transfection-reagent) - [Preparation of Cationic Liposomes & Transfection of Cells - Avanti Research™ Polar Lipids](https://www.sigmaaldrich.com/PL/en/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/transfection-and-gene-editing/preparation-of-cationic-liposomes-transfection-of-cells0) - [Protocol for Transducing Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) using MISSION® ExpressMag™ Super Magnetic Kit®](https://www.sigmaaldrich.com/PL/en/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/transfection-and-gene-editing/transducing-mouse-embryonic-fibroblasts) - [Zobacz więcej](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) __Powiązane kategorie produktów__ - [Ekspresja i wyciszanie genów](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/applications/genomics/gene-expression-and-silencing) - [Protokół odczynnika do transfekcji siRNA X-tremeGENE™ i rozwiązywanie problemów](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/cell-culture-and-cell-culture-analysis/transfection-and-gene-editing/x-tremegene-sirna-transfection-reagent) - [Edycja genomu za pomocą nukleazy RNA CRISPR Cas 9](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/advanced-gene-editing/crispr-cas9-genome-editing) - [Edycja genomu roślin za pomocą CRISPR/Cas9](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/advanced-gene-editing/genome-editing-in-plants-with-crispr-cas9) - [Protokół transdukcji lentiwirusowej](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/advanced-gene-editing/lentiviral-transduction) - [Biodegradowalne nanocząsteczki](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/protocol/genomics/gene-expression-and-silencing/biodegradable-nanoparticles) - [Bioluminescencyjne testy lucyferazy Firefly](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/imaging-analysis-and-live-cell-imaging/firefly-luciferase-assays) - [Wprowadzenie do transfekcji komórek](https://www.sigmaaldrich.com/PL/pl/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/transfection-and-gene-editing/transfection-reagents) Góra __Zaloguj się, aby kontynuować__ Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować. Zaloguj się__Nie masz konta użytkownika?__Zarejestruj Dla wygody naszych klientów ta strona została przetłumaczona maszynowo. Dołożyliśmy starań, aby zapewnić dokładne tłumaczenie maszynowe. Tłumaczenie maszynowe nie jest jednak doskonałe. Jeśli tłumaczenie maszynowe nie spełnia Twoich oczekiwań, przejdź do wersji w języku angielskim. An unknown error has occured.