Wektory ekspresyjne systemu 3xFLAG^® do ultraczułego wykrywania rekombinowanych białek

System 3xFLAG^® stanowi udoskonalenie oryginalnego systemu poprzez połączenie trzech tandemowych epitopów FLAG^® dających łącznie 22 aminokwasy (Rysunek 1). Wykrywanie białek fuzyjnych zawierających 3xFLAG^® jest wzmocnione do 200 razy bardziej niż jakikolwiek inny system. Podobnie jak oryginalny znacznik FLAG, 3xFLAG^® jest hydrofilowy, zawiera miejsce rozszczepienia Enterokinazy i jest stosunkowo mały. Dlatego ryzyko zmiany funkcji białka, blokowania innych epitopów lub zmniejszenia rozpuszczalności jest zminimalizowane. W przypadku niskiego poziomu ekspresji, 3xFLAG^® jest idealnym rozwiązaniem. Nasz wybór wektorów  CMV zapewnia opcje dla przejściowej lub stabilnej ekspresji 3xFLAG^® białek fuzyjnych.

• Ultrasensitive System - Detect < 10 femtomoli przy użyciu przeciwciał ANTI-FLAG^® (Rysunek 2); Idealny w przypadkach niskiego poziomu ekspresji w komórkach ssaków.
• Superior Detection - 20-200x bardziej czuły niż jakikolwiek inny system (Rysunek 3).
• Wszechstronność - Ulepszona detekcja dla immunoprecypitacji, Western blot i immunocytochemii.
• Szeroki wybór produktów do wykrywania i oczyszczania - Przeciwciała ANTI-FLAG, żywice i płytki do wychwytywania powinowactwa.

Rysunek 1. Sekwencja 3xFLAG®. Usunięcie N-końcowych znaczników 3xFLAG® jest możliwe przy użyciu enterokinazy, która rozszczepia sekwencję aminokwasów Asp-Asp-Asp-Asp-Lys na c-końcowym końcu znacznika.

Rysunek 2. Western blot oryginalnego FLAG i 3xFLAG®. Western blot oczyszczonego 3xFLAG®-BAP (bakteryjna fosfataza alkaliczna) i FLAG®-BAP przeniesionego na membranę nitrocelulozową. Detekcję przeprowadzono przy użyciu pierwotnego przeciwciała monoklonalnego ANTI-FLAG® M2, wtórnego przeciwciała anty-mysiego-HRP i substratu chemiluminescencyjnego ECL™.

 

Rysunek 3. Czułość porównawcza 3xFLAG®. Każdy znacznik fuzyjny białka został sklonowany oddzielnie na C-końcu GST. Oczyszczone białka rozcieńczono od 1 ug do 0,01 ng i poddano analizie. Granicę wykrywalności każdego znacznika określono za pomocą analizy Western blot przy użyciu zalecanych rozcieńczeń każdego odpowiedniego przeciwciała pierwotnego i drugorzędowego koniugatu anty-mysiej IgG-HRP. Blot został opracowany przy użyciu ECL.

 

Cechy wektorów CMV

Nasze wektory ekspresyjne dla ssaków zawierają silny promotor CMV zapewniający wysoki poziom konstytutywnej ekspresji w komórkach ssaków. Silny region regulatorowy promotora ludzkiego wirusa cytomegalii (CMV) napędza konstytutywne poziomy ekspresji białka tak wysokie, jak 1 mG/L w komórkach COS. W przypadku słabszych linii komórkowych poziom białka wynosi zazwyczaj ~0,1 mG/L. Obecność genu replikacyjnego SV40 skutkuje wysokim poziomem replikacji DNA w komórkach COS dopuszczających replikację SV40. Wektory zawierające sekwencję lidera preprotrypsyny (PPT) kierują wydzielanie białek fuzyjnych FLAG do pożywki hodowlanej w celu oczyszczenia za pomocą przeciwciał ANTI-FLAG, żywic i płytek.

Wektory do ekspresji przejściowej

• Fuzje N-końcowe
• Ekspresja cytoplazmatyczna
• Sekwencja wiodąca PPPT do wydzielania
• Konfiguracje z podwójnym znacznikiem
• Usuwanie przez enterokinazę 3xFLAG^® tag
• pochodzenie pMB1 (pochodna pBR322) do replikacji w komórkach bakteryjnych
• gen beta-laktamazy do selekcji oporności na ampicylinę u bakterii

 

Rysunek 4. Regiony MCS

Wektory stabilnej ekspresji

• Stabilna ekspresja z selekcją neomycyną (siarczan G 418)
• Konfiguracje terminala N lub C
• Ekspresja cytoplazmatyczna lub wydzielanie
• Fuzje N- lub C-końcowe
• Konfiguracje podwójnych znaczników
• Ekspresja cytoplazmatyczna lub wydzielanie
• Usuwanie przez enterokinazę N-końcowych znaczników 3xFLAG^®
• pochodzenie pMB1 (pochodna pBR322) do replikacji w komórkach bakteryjnych
• gen beta-laktamazy do selekcji oporności bakterii na ampicylinę

Rysunek 5. Stabilny wektor ekspresji

wektory stabilnej ekspresji BICEP™

• Najwyższa stabilna ekspresja
• Neo^r gen jest translowany w sposób niezależny od czapeczki pod kontrolą EMCV IRES
• Stabilna produkcja linii komórkowej bez obawy o utratę plazmidu
• Poziom ekspresji przewyższa konkurencję 30-krotnie
• Utrzymuje wysoki poziom ekspresji po wielu pasażach

Rysunek 6. Wektor stabilnej ekspresji Bicep