NMR เชิงปริมาณสำหรับการกำหนดเนื้อหาของมาตรฐานอ้างอิงสำหรับการควบคุมคุณภาพของผลิตภัณฑ์สมุนไพร

Markus Veit

i.DRAS GmbH, Fraunhoferstrasse 18b, 82152 Planegg/Martinsried, Germany

AnalytiX Volume 10 Article 1

[email protected]

ภายในขอบเขตของขั้นตอนการอนุมัติการตลาดสำหรับผลิตภัณฑ์สมุนไพรเอกสารที่ครอบคลุมและใบรับรองการวิเคราะห์จะต้องรวบรวมไว้สำหรับมาตรฐานอ้างอิงทั้งหมดที่ใช้ ในเอกสารนี้ข้อมูลเกี่ยวกับตัวตน (NMR, MS, IR, UV และอื่นๆ), ความบริสุทธิ์ (ปริมาณน้ำตัวทำละลายตกค้างสิ่งสกปรกอนินทรีย์และสิ่งสกปรกอินทรีย์) และต้องมีเนื้อหาของมาตรฐานอ้างอิง ในปัจจุบันการวิเคราะห์จะดำเนินการโดยใช้สองวิธีซึ่งควรจะเป็นอิสระจากกันและกัน เพื่อวัตถุประสงค์นี้โดยปกติจะใช้วิธีการโครมาโตกราฟี จากนั้นการกำหนดเนื้อหาจะดำเนินการตามผลลัพธ์ที่ได้จากการทดสอบความบริสุทธิ์และเปอร์เซ็นต์พื้นที่ที่เกี่ยวข้องของ analyte ในระบบแยก chromatographic อย่างไรก็ตามขั้นตอนนี้ใช้ได้กับมาตรฐานอ้างอิงที่มีความบริสุทธิ์เพียงพอ (> 99 ร้อยละ 5 เท่านั้น)

มาตรฐานอ้างอิงของแหล่งกำเนิดตามธรรมชาติมักจะมีโครงสร้างโมเลกุลที่ซับซ้อนซึ่งเป็นเหตุผลที่พวกเขาไม่ค่อยสามารถเข้าถึง synthetically และจึงต้องแยกออกจากแหล่งธรรมชาติ เมื่อแยกสารออกจากพืชแต่ความบริสุทธิ์เกิน 99 5% สามารถทำได้ด้วยความพยายามอย่างมากเท่านั้น นอกจากนี้ขอบเขตของการแยกบริสุทธิ์จะดำเนินการผ่านวิธีการ chromatographic ดังนั้นวิธีการเดียวกันมักจะถูกนำมาใช้สำหรับเนื้อหาและสำหรับการวิเคราะห์ความบริสุทธิ์ภายในกรอบของการรับรอง ความซ้ำซ้อนนี้ส่งผลให้เกิดความเสี่ยงที่สิ่งสกปรกที่ไม่สามารถแยกออกได้ในระหว่างการทำให้บริสุทธิ์อาจถูกมองข้ามในระหว่างการรับรอง สิ่งสกปรกดังกล่าวมักเกี่ยวข้องกับ biogenetically กับ analyte และแสดงโครงสร้างที่คล้ายกันมากซึ่งทำให้การแยกวิเคราะห์ยากยิ่งขึ้น ดังนั้นความสามารถในการเลือก (หรือความจำเพาะ) ของ themethod ที่ใช้สำหรับการทดสอบความบริสุทธิ์มีบทบาทสำคัญโดยเฉพาะอย่างยิ่งในแง่ของมาตรฐานอ้างอิงที่แยกและบริสุทธิ์จากแหล่งธรรมชาติ ด้วยเหตุนี้มาตรฐานอ้างอิงที่แยกได้จากแหล่งธรรมชาติจึงแทบจะไม่ได้รับการรับรองตามแนวทางที่เกี่ยวข้องโดยใช้ขั้นตอนที่กำหนดไว้

หลีกเลี่ยงปัญหาทั้งหมดที่อธิบายไว้วิธีการวัดหลัก " โดยตรง " หรือ " ญาติ " ที่ถ่ายทอดการตรวจสอบย้อนกลับโดยตรงไปยังหน่วย SI ช่วยให้มั่นใจได้ถึงคุณภาพทางมาตรวิทยาที่สูงขึ้น¹ วิธีการเหล่านี้จะถูกนำไปใช้มากขึ้นสำหรับการกำหนดเนื้อหาของผลิตภัณฑ์ธรรมชาติที่ใช้เป็นมาตรฐานอ้างอิงยา.

ปริมาณ NMR สเปกโตรสโกปี (QNMR) เป็นวิธีหลักที่สัมพันธ์กัน^{ที่มีศักยภาพ 2} การจ้างงานของ qNMR ทำให้ง่ายขึ้นและเพิ่มความน่าเชื่อถือของการสร้างมาตรฐานอ้างอิงและการรับรองของพวกเขา พื้นฐานที่สำคัญที่สุดของสเปกโตรสโกปี NMR เชิงปริมาณคือสัดส่วนโดยตรงของความเข้มของสัญญาณที่มีจำนวนของนิวเคลียสที่เอื้อต่อสายเรโซแนนซ์

โดยทั่วไปมีความเป็นไปได้สองประการในการวิเคราะห์เนื้อหา: การวิเคราะห์โดยตรงผ่านองค์ประกอบหลักและการวิเคราะห์ทางอ้อมผ่านสิ่งสกปรก เนื่องจากการกำหนดเนื้อหามีบทบาทสำคัญในการรับรองมาตรฐานอ้างอิงจึงมีการใช้วิธีการโดยตรงที่นี่ ในการทำเช่นนั้นองค์ประกอบหลักเช่นมาตรฐานอ้างอิงจะได้รับการประเมินเทียบกับมาตรฐานภายใน ข้อดีของวิธีนี้อยู่ที่ความจริงที่ว่าจำเป็นต้องมีการกำหนดสัญญาณที่สามารถรวมสัญญาณได้อย่างเหมาะสมของส่วนประกอบหลักเท่านั้น ในบริบทนี้ความรู้เกี่ยวกับองค์ประกอบและ/หรือการกำหนดคุณภาพของสัญญาณอื่นมักจะไม่จำเป็น สำหรับการกำหนดเนื้อหาของส่วนประกอบหลักจะต้องชั่งน้ำหนักมาตรฐานภายในและการวิเคราะห์ร่วมกันในหลอด NMR หนึ่งหลอด ความเข้มของสัญญาณการเลือกที่เหมาะสมขององค์ประกอบหลักและมาตรฐานภายในจะใช้สำหรับการคำนวณ ขึ้นอยู่กับอัตราส่วนของความเข้มข้นเนื้อหาสัมพัทธ์ของ Analyte สามารถคำนวณได้เป็น m/m%

ตัวอย่างเช่นสเปกตรัมของ vitexin 2 "-O-rhamnoside ที่มีกรดเบนโซอิก 2 ไฮดรอกซี 3,5 dinitro เป็นมาตรฐานภายในจะแสดงใน รูปที่ 1

รูปที่ 1 สเปกตรัม NMR ของ vitexin 2 "-O-rhamnoside และมาตรฐานภายใน 2 ไฮดรอกซี 3,5 dinitro benzoic acid สำหรับปริมาณของเนื้อหาของส่วนประกอบหลักสัญญาณของโปรตอน H6 ของ vitexin 2 "-O-rhamnoside และโปรตอนอะโรมาติก (H4 และ H6) ของกรดเบนโซอิก 2 ไฮดรอกซี 3,5 dinitro

ในท้ายที่สุดไม่เพียงแต่การกำหนดเนื้อหาเท่านั้นที่สามารถทำได้โดยใช้วิธีการที่อธิบายไว้แต่ยังรวมถึงหลักฐานของตัวตนในขั้นตอนเดียวโดยใช้วิธี NMR ในแบบคลาสสิกสำหรับการวิเคราะห์โครงสร้าง ดังนั้นสารที่ให้มาซึ่งต้องได้รับการรับรองเช่นผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติที่มีราคาแพงมากอาจลดลงได้ดังนั้นจึงช่วยลดต้นทุนที่สูงที่เกี่ยวข้องกับความพยายามอย่างกว้างขวางในการเชื่อมต่อกับการแยกและการทำให้บริสุทธิ์

CCQM ยุโรป (Comit é Consultatif เทลาควอนติเตเดอมาติแยร์) ช่วยให้มั่นใจได้ถึงความกลมกลืนของพารามิเตอร์ทางกายภาพรวมทั้งการอธิบายและปรับปรุงความแม่นยำและความแม่นยำของวิธีการวัดในเคมีวิเคราะห์ จากคำสั่ง CCQM สถาบันการวิจัยและทดสอบวัสดุแห่งชาติเยอรมัน (BAM) ได้รับการเรียกเก็บเงินจากการกำหนดความสามารถของสเปกโตรสโกปี NMR เชิงปริมาณและพิสูจน์ประสิทธิภาพในการทดสอบระหว่างห้องปฏิบัติการระหว่างประเทศ³ ในแง่นี้ BAM ทำหน้าที่เป็นสถาบันมาตรวิทยาแห่งชาติของเยอรมนี ภายในโครงการที่ได้รับการสนับสนุนจากสาธารณะในประเทศเยอรมนีผลการตรวจสอบที่ครอบคลุมสำหรับการรับรองมาตรฐานอ้างอิงสามารถจัดตั้งขึ้นซึ่งส่วนใหญ่มีให้สาธารณชนในขณะนี้⁴ เนื่องจากสเปกโตรสโกปี NMR มีลักษณะของวิธีการหลักดังที่แสดงในสิ่งพิมพ์สำหรับ CCQM^3,4ความต้องการทั้งหมดมีความพึงพอใจที่จะทำการรับรองคุณภาพสูงสุดตามมาตรฐาน SI สำหรับวัสดุอ้างอิงทางเภสัชกรรม In Ph. ยูโร Monograph บนสเปกโตรสโกปี NMR ได้รับการแก้ไขตามผลของโครงการวิจัยตอนนี้อนุญาตให้ใช้ qNMR เป็นวิธีการอย่างเป็นทางการในการวิเคราะห์ยา

ในระหว่างการตระหนักถึงโครงการนี้ qNMR สามารถพิสูจน์ได้ว่ามีความเหมาะสมโดยทั่วไปเป็น analyticalmethod หลักที่มีศักยภาพสำหรับการรับรองผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติเป็นมาตรฐานอ้างอิงสำหรับการควบคุมคุณภาพของผลิตภัณฑ์สมุนไพร ใช้ตัวอย่างเอกสารอ้างอิงที่เลือกทั้งหมด 14 ตัวอย่างที่เกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์สมุนไพรคุณภาพทางพยาธิวิทยาของปริมาณ 1 H-NMR และด้วยเหตุนี้จึงมีการตรวจสอบความเหมาะสมสำหรับการวิเคราะห์ทางเภสัชกรรม

การกำหนดสัญญาณเชิงคุณภาพในสเปกตรัม (ความจำเพาะและการเลือก) แสดงให้เห็นว่าเป็นส่วนที่สำคัญที่สุดของการวิเคราะห์เชิงปริมาณ ยิ่งโมเลกุลใหญ่และซับซ้อนมากเท่าใดการประเมินผลก็ยิ่งยากขึ้นเท่านั้น นอกจากนี้ aggravating เป็นความจริงที่ว่าในกรณีของสารประกอบที่ซับซ้อนสิ่งสกปรกที่มีโครงสร้างที่คล้ายกันมากแตกต่างกันเพียงเล็กน้อยในสเปกตรัมและ/หรือเพียงไม่กี่ความถี่ อย่างไรก็ตามปัญหานี้ไม่ใช่เฉพาะ NMRSpecific แต่สามารถถ่ายโอนไปยังวิธีการสเปกโตรสโคปและโครมาโตกราฟีทั้งหมดได้ อย่างไรก็ตามเมื่อวิธีการอื่นล้มเหลวเนื่องจากไม่สามารถเลือกวิเคราะห์ได้ QNMR ให้ผลลัพธ์ที่ถูกต้องในกรณีดังกล่าวโดยการประเมินผ่านสัญญาณเพิ่มเติมในสเปกตรัม นอกจากนี้สำหรับสารบางชนิดสิ่งสกปรกเพิ่มเติมที่ตรวจไม่พบโดยใช้วิธีการโครมาโตกราฟีสามารถตรวจจับได้และแม้กระทั่งการระบุและวัดค่าบางส่วนโดย qNMR สำหรับ analyte เป้าหมายแต่ละตัวการเลือกสัญญาณที่ใช้สำหรับการวิเคราะห์ได้รับการจัดตั้งขึ้นโดยวิธีการของ 1 H-NMR (บางส่วนใช้ 13 เท่า) และ 1 ชม., 13 องศาเซลเซียสเทคนิค NMR 2 มิติ (HMQC, HMBC) และสำหรับการกำหนดสัญญาณที่เกิดจากสิ่งสกปรกจาก H, H correlated 2 เทคนิค DNMR(Cozy)

ด้วยเหตุนี้ขั้นตอนการทำงานมาตรฐานจึงพร้อมใช้งานสำหรับการบันทึกการประมวลผลและการประเมินผลการวัด qNMR สำหรับการรับรองมาตรฐานอ้างอิง

เพื่อยืนยันการยอมรับผล qNMR โดยหน่วยงานกำกับดูแลแห่งชาติเยอรมัน (BfArM) และยุโรป EMEA การศึกษาเหล่านี้ได้ดำเนินการตามแนวทาง ICH⁵ โดยวิธีการของการจัดและประเมินผลการทดสอบระหว่างห้องปฏิบัติการแห่งชาติกับ 22 ผู้เข้าร่วมจากอุตสาหกรรมการวิจัยและสิ่งอำนวยความสะดวกของมหาวิทยาลัยทั่วไปของการตรวจสอบภายในห้องปฏิบัติการได้รับการพิสูจน์อย่างชัดเจนบนพื้นฐานของสารหนึ่ง

เพื่อตรวจสอบคุณภาพทางมาตรวิทยา (ความแม่นยำและความแม่นยำ) งบประมาณความไม่แน่นอนที่สมบูรณ์ตามแนวทาง ISO ได้รับการจัดตั้งขึ้นสำหรับการทดสอบโดยใช้สเปกโตรสโกปี qNMR โดยทั่วไปแล้วความไม่แน่นอนที่เพิ่มขึ้นของการวัด (k = 2 จาก≤ 1 กรัม/กรัม % จะถูกกำหนดสำหรับสารทั้งหมดที่ตรวจสอบ

ข้อมูลอ้างอิง

1. Malz F. 2003. Quantitative NMR-Spektroskopie als Referenzverfahren in der analytischen Chemie. Dissertation Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin..

2. Jancke H. 1998. NMR als primäre analytische Meßmethode. Nachr. Chem. Tech. Lab.. 46(7-8):720-722. https://doi.org/10.1002/nadc.19980460711

3. Jancke H. 1998. NMR Spectroscopy as a Primary Analytical Method. Document 98/02 to the 4th Session of the CCQM, Sèvres..

4. Malz F, Jancke H. 2005. Validation of quantitative NMR. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 38(5):813-823. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2005.01.043

5. ICH Q2R: Validation of analytical procedures. Available at:. www.emea.europa.eu/pdfs/human/ich/038195en.pdf