เคล็ดลับและเทคนิคสำหรับ Chromatography บางชั้น

Monika Bäumle, Global Product Manager TLC, Ilona Matus, Analytical Sciences Liaison

Merck

Article from Analytix Reporter - Issue 14

บทนำ

โครมาโตกราฟีแบบบาง (TLC) เป็นเทคนิคการแยกที่รวดเร็วใช้งานง่ายและมีความหลากหลายสูงสำหรับการวิเคราะห์เชิงคุณภาพและเชิงปริมาณ เหมาะอย่างยิ่งสำหรับการระบุตัวตนการคัดกรองและการตรวจสอบปฏิกิริยาอย่างรวดเร็ว ความทนทานต่อเมทริกซ์สูงและความเป็นไปได้ในการแยกตัวอย่างหลายตัวอย่างแบบขนานทำให้ TLC มีเวลาและคุ้มค่ามาก

หลักการทำงานของ TLC

กระบวนการโครมาโตกราฟีแบบบางทั่วไปนั้นง่ายแต่ก็รวมถึงขั้นตอนต่างๆและข้อควรระวังบางอย่างต้องได้รับการพิจารณา (รูปที่ 1)

ตัวอย่างหนึ่งคือระยะของก๊าซในห้องพัฒนาซึ่งมีผลต่อกระบวนการ TLC ดังนั้นจึงเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องรักษาสภาวะของก๊าซและความชื้นที่มีการควบคุมเพื่อให้ได้ประสิทธิภาพที่สามารถทำซ้ำได้และผลลัพธ์ TLC ที่แม่นยำ ในหัวข้อต่อไปนี้เราจะกล่าวถึงแง่มุมที่สำคัญบางประการซึ่งควรได้รับการพิจารณาในขั้นตอนต่างๆ

รูปที่ 1 TLC process.

การจัดเก็บและการจัดการแผ่น TLC

ชั้น TLC เป็นวัสดุที่ใช้งานสูงและสามารถดูดซับความชื้นและสารปนเปื้อนที่เกิดจากสภาพแวดล้อมในห้องปฏิบัติการ ดังนั้นจึงแนะนำให้จัดเก็บแผ่นความร้อนในสภาพแวดล้อมที่สะอาดและแห้ง (เช่นในเครื่องดูดความชื้น) หากเป็นไปได้ให้พันเพลทในแผ่นอะลูมิเนียมฟอยล์และเก็บให้ห่างจากควันและไอสารเคมี

การเตรียมแผ่น TLC: การล้างล่วงหน้า (การล้าง) และการเปิดใช้งานเลเยอร์

สารปนเปื้อนและความชื้นจากสภาพแวดล้อมสามารถเปลี่ยนแปลงประสิทธิภาพของแผ่นโดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อไม่ได้จัดเก็บอย่างถูกต้องหลังจากเปิดแพคเกจ นอกจากนี้เพลทอาจมีสิ่งสกปรกจากสารยึดเกาะบรรจุภัณฑ์หรือการจัดการก่อนหน้า สารปนเปื้อนเหล่านี้สามารถ/ควรถูกกำจัดออกได้โดยการล้างชั้นก่อน ซึ่งสามารถทำได้โดยการจุ่มลงในตัวทำละลาย (หนึ่งหรือสองครั้ง 1-7 นาที) หรือโดยการทำงานที่ว่างเปล่าของแผ่น TLC เช่นด้วยเมทานอล ระวังทิศทางโครมาโตกราฟีเพราะสิ่งสกปรกจะมีสมาธิที่ขอบด้านบนของแผ่น

ในการขจัดน้ำที่ไหลเข้าไปในกลุ่มการทำงานของขั้วโลกของเฟสขอแนะนำให้อุ่นแผ่นความร้อนเป็นเวลา 20 – 30 นาทีที่อุณหภูมิ 120°C (ในเตาอบที่สะอาด) เพื่อการเปิดใช้งานแผ่นความร้อนที่เหมาะสม

TLC Sample Preparation

แผ่น Chromatography แบบบางเป็นอุปกรณ์ที่ใช้ครั้งเดียวดังนั้นจึงไม่มีความเสี่ยงต่อการปนเปื้อนข้ามไปยังการวิเคราะห์ในอนาคต ด้วยเหตุนี้การเตรียมตัวอย่างจึงสามารถทำได้ง่ายขึ้นและใช้เวลาน้อยลงเมื่อเทียบกับ HPLC แนะนำให้ใช้การบด/การทำให้เป็นเนื้อเดียวกันและการสกัดตัวอย่างด้วยสารเจือจางที่เหมาะสม (เช่นสำหรับตัวอย่างที่เป็นของแข็ง) ในที่สุดตามด้วยขั้นตอนการกรองและความเข้มข้น

ทางเลือกของเฟสนิ่งใน TLC

ทางเลือกของระยะหยุดนิ่งของ TLC เป็นสิ่งสำคัญเนื่องจากเป็นตัวกำหนดประสิทธิภาพการเลือกและการแยก มีตัวเลือกมากมาย - ขึ้นอยู่กับซิลิกาอลูมิเนียมออกไซด์หรือเซลลูโลสดัดแปลงหรือไม่ดัดแปลง การเลือกควรสัมพันธ์กับคุณสมบัติของตัวอย่างและเป้าหมายการสมัครของคุณ TLC สามารถทำงานได้ในสองโหมดโหมดโหมดเฟสปกติและโหมดย้อนกลับ ในโหมดเฟสปกติ (NP) เฟสเคลื่อนที่จะมีขั้วน้อยกว่าเฟสที่หยุดนิ่งบนแผ่น TLC ในขณะที่ในเฟสย้อนกลับ (RP) เฟสเคลื่อนที่จะมีขั้วมากกว่าเฟสที่อยู่กับที่ มากกว่า 80 เปอร์เซ็นต์ของการแยก TLC ทั้งหมดจะทำบนซิลิกาเจลเป็นเฟสนิ่งไม่ว่าจะเปลือยหรือดัดแปลงด้วยเช่น C18

วิธีการเลือกระบบตัวทำละลายสำหรับ TLC?

การเลือกระยะเคลื่อนที่ใน TLC เป็นปัจจัยสำคัญอีกประการหนึ่งสำหรับผลลัพธ์การแยกที่มีประสิทธิภาพ ตัวทำละลายจะละลายส่วนประกอบของตัวอย่างบนชั้นดูดซับและเคลื่อนไปตามแผ่น ระยะเคลื่อนที่ที่เหมาะสมจะขนส่งส่วนประกอบทั้งหมดจากเบสไลน์ที่มี ค่า R F (ปัจจัยการเก็บรักษา) สุดท้ายระหว่าง 0.15 ถึง 0.85 (โดยหลักการแล้วคือ 0.2 – 0.6 ปัจจัยการเก็บรักษาจะถูกกำหนดเป็นระยะทางที่เดินทางโดยสารหารด้วยระยะทางที่ตัวทำละลายเดินทาง โดยปกติแล้วสิ่งเหล่านี้จะอธิบายเป็น hr_fซึ่งกำหนดเป็น 100 x r_f เมื่อมีการพัฒนาวิธีการตั้งแต่เริ่มต้นโดยทั่วไปจะใช้ตัวทำละลายขั้วและไม่มีขั้วเป็นจุดเริ่มต้น ในการเพิ่ม ค่า R F ใน NP-TLC จำเป็นต้องเพิ่มขั้วของเฟสมือถือ ในกรณีที่ จำเป็นต้องลด R F จะต้องลดขั้วลง ระบบเฟสมือถือที่พบบ่อยมากใน NP-TLC มีเฮกเซนและเอทิลอะซิเตท 10 - 50% (ETOAC) ระบบตัวทำละลายที่โดดเด่นอื่นๆขึ้นอยู่กับเมทานอลและไดคลอโรมีเทนโทลูอีนหรืออะซิโตน ใน RP-TLC ระบบตัวทำละลายเป็นสารผสมโดยทั่วไปขึ้นอยู่กับน้ำเมทานอลอะซิโตไนไตรล์หรือบัฟเฟอร์น้ำ

ตัวทำละลายที่ใช้และตัวทำละลายผสมควรมีความบริสุทธิ์และเสถียรภาพที่เพียงพอความหนืดต่ำความดันไอต่ำและความเป็นพิษต่ำถ้าเป็นไปได้

การเพิ่มตัวปรับเปลี่ยนบางอย่าง (พื้นฐานหรือเป็นกรด) อาจปรับปรุงผลการแยก

วิธีการที่เป็นระบบอย่างละเอียดในการค้นหาระบบตัวทำละลายที่เหมาะสามารถติดตามได้ตามข้อมูลที่เผยแพร่¹

Sample Application

ตัวอย่างสามารถใช้เป็นจุดหรือแถบโดยการสัมผัสหรือฉีดพ่น การใช้ตัวอย่างโดยการฉีดพ่นในแถบช่วยให้ได้ผลการแยกที่ดีขึ้นและเป็นวิธีที่ควรใช้เมื่อมีปริมาณตัวอย่างมากขึ้น มีอุปกรณ์พิเศษสำหรับฉีดพ่นสารละลายตัวอย่างลงบนเพลท วิธีนี้จะหลีกเลี่ยงการสัมผัสกับชั้น TLC โดยตรงและโดยทั่วไปจะใช้สำหรับการใช้งานสาย

ขั้วของสารเจือจางตัวอย่างเป็นปัจจัยที่ต้องพิจารณา ใน NP-TLC จะใช้สารเจือจางที่ไม่ใช่ขั้วเช่น n-hexane ซึ่งทำให้มั่นใจได้ว่าสารยังคงอยู่ที่จุดสมัคร อย่างไรก็ตามด้วยสารเจือจางขั้วมากขึ้น (เช่นโทลูอีนไดคลอโรมีเทนเมทานอล) สารตัวอย่างจะถูกส่งไปยังขอบของ " โซนเปียก " (จุดที่เส้นเริ่มต้น) และโดยปกติจะเป็นจุดโครมาโตกราฟีวงกลมที่บริเวณเริ่มต้น (ดูด้านบนของ รูปที่ 2) เช่นเดียวกับในการพัฒนาโครมาโตกราฟียอดที่มีการกระจายแบบเกาส์เกือบจะประสบความสำเร็จซึ่งจะขยายตัวขึ้นด้วยขั้วที่เพิ่มขึ้นของตัวเจือจาง ( รูปด้านล่าง 2)

รูปที่ 2 การกระจายสารในจุดตัวอย่างหลังจากการใช้งานบนแผ่น TLC เป็นหน้าที่ของตัวทำละลาย

เลือกขนาดแผ่นที่เหมาะสมหรือตัดแผ่นที่ใหญ่กว่าตามขนาดที่ต้องการตามจำนวนตัวอย่างที่จะวิเคราะห์ ทำเครื่องหมายโซนการใช้งานด้วยดินสอโดยวาดเส้นบนแผ่น ระวังอย่าให้เกิดความเสียหาย/รอยขีดข่วนบนพื้นผิวของชั้นเนื่องจากอาจส่งผลต่อลักษณะการไหลและทำให้เกิดข้อผิดพลาดได้ ระวังอย่าให้ตัวอย่างใกล้กับขอบด้านล่างของเพลทมากเกินไป (จากขอบด้านล่าง 8 มม.) เนื่องจากอาจทำให้จุดเริ่มต้นแพร่กระจาย/แยกเข้าสู่เฟสเคลื่อนที่ได้ ปริมาณตัวอย่างที่จะใช้ขึ้นอยู่กับเป้าหมายของการวิเคราะห์และความเข้มข้นของสารละลายตัวอย่าง โดยทั่วไปปริมาณตัวอย่าง 0.5 - 2.0 µL μ m จะแนะ µL สำหรับการทดสอบตัวตนและสูงสุด 10 μ m สำหรับการทดสอบความบริสุทธิ์ ปริมาณตัวอย่างที่สูงขึ้นสารระเหยและไม่มีขั้ว (สำหรับ NP) ตัวเจือจางควรจะมากขึ้นและควรใช้งานช้าลง

แผ่นทำความร้อนแห้งก่อนการพัฒนา

หลังจากใส่ตัวอย่างลงบนจานแล้วต้องถอดสารเจือจางตัวอย่างออกอย่างสมบูรณ์โดยการอบแผ่นให้แห้งอย่างระมัดระวังก่อนที่จะเกิดการพัฒนา หลีกเลี่ยงการปนเปื้อนด้วยควันในระหว่างขั้นตอนนี้และเลือกอุณหภูมิที่เหมาะสมเพื่อไม่ให้เกิดการแพร่กระจายหรือการสูญเสียตัวอย่าง อุณหภูมิขึ้นอยู่กับชนิดของสารเสถียรภาพและจุดเดือด

การปรับสภาพชั้น/การควบคุมความชื้นล่วงหน้า

ความชื้นในห้องปฏิบัติการสามารถลดกิจกรรมของชั้น TLC ได้ภายในไม่กี่นาทีเนื่องจากความสมดุลเกิดขึ้นอย่างรวดเร็วระหว่างบรรยากาศในห้องปฏิบัติการและตัวดูดซับ การปรับสภาพแผ่น TLC ก่อนการพัฒนาจะช่วยหลีกเลี่ยงการเสื่อมสภาพ ดังนั้นให้ปรับสภาพจานของคุณ (หลังจากการใช้ตัวอย่าง) เป็นเวลา 45 นาทีสำหรับสารละลายเกลืออิ่มตัวในห้องปิด ขึ้นอยู่กับความชื้นสัมพัทธ์ที่ต้องการแนะนำให้ใช้สารละลายเกลืออิ่มตัวหลายชนิดเช่นความชื้นสัมพัทธ์ 33% โดยใช้ สารละลาย MgCl 2 อิ่มตัว ตรวจสอบให้แน่ใจว่าเกลือยังไม่ละลายในสารละลายเพื่อให้แน่ใจว่ามีความอิ่มตัว หลังจากปรับสภาพเป็นสิ่งสำคัญในการพัฒนาแผ่นทันทีเพื่อป้องกันการเกิดซ้ำของการเปลี่ยนแปลง

โครมาโตแกรม/การพัฒนาแผ่น

การพัฒนาแผ่น TLC สามารถทำได้โดยใช้เทคนิคต่างๆเช่นแบบหนึ่งมิติสองมิติหรือผ่านกระบวนการไหลแบบบังคับ มิติเดียวสามารถเป็นการพัฒนาเดียวหรือหลายและทำงานในแนวตั้งแนวนอนหรือวงกลม ในกรณีส่วนใหญ่การแยกจะทำในแนวตั้งในห้องพัฒนา

ก่อนอื่นให้เพิ่มระยะเคลื่อนที่ที่เตรียมไว้ใหม่ในห้องพัฒนาไปยังระดับสูงสุด 0.5 ซม. (สายจุ่ม) ก่อนที่จะเริ่มกระบวนการพัฒนาจำเป็นต้องมีความสมดุลระหว่างเฟสของของเหลวและเฟสของก๊าซเพื่อให้เกิดความอิ่มตัวของห้อง เพื่อความสะดวกรวดเร็วยิ่งขึ้นให้เพิ่มแผ่นอิ่มตัวหรือวางกระดาษกรองไว้ภายในห้อง (ผนังห้อง) และปรับสมดุลเป็นเวลา 20 นาที (ปิดห้องไว้) หลังจากความอิ่มตัวของห้องให้วางจานอย่างรวดเร็วภายในห้อง ทันทีที่ระยะเคลื่อนที่ได้เคลื่อนที่ไปสองในสามของขนาดแผ่น (สูงสุด 1 ซม. จากด้านบน) ให้ถอดแผ่นและทำเครื่องหมายด้านหน้าตัวทำละลาย หลังจากการพัฒนาแผ่นควรแห้งอย่างถูกต้องเพื่อลบตัวทำละลายที่เหลือก่อนการสร้างภาพ

การแปลงค่าใน TLC

หลังจากการแยกโดยปกติแล้วการสร้างอนุพันธ์จะทำเพื่อเปิดใช้งานการแสดงภาพของ analytes และการเพิ่มประสิทธิภาพของการตรวจจับหากส่วนประกอบตัวอย่างไม่มีสีหรือไม่มีฟลูออเรส ตัวทำปฏิกิริยาการแปลงค่า/การตรวจจับที่เหมาะสมที่สุดจะขึ้นอยู่กับ Analyte เป้าหมายและวิธีการตรวจจับที่ต้องการ อาจนำไปใช้ก่อนการพัฒนา (pre-chromatographic derivatization) ด้วยระบบตัวทำละลาย (การสร้างอนุพันธ์ในไซต์) หรือหลังการพัฒนา (post-chromatographic derivatization)

สำหรับการสร้างอนุพันธ์หลังโครมาโตกราฟีหรือการแสดงภาพของ Analyte น้ำยาจะถูกนำไปใช้กับแผ่นโดยการฉีดพ่นหรือจุ่ม ข้อดีของการฉีดพ่นคือความยืดหยุ่นสูงและปริมาณน้ำยาต่ำที่ต้องการ อย่างไรก็ตามการฉีดพ่นแบบแมนนวลมักไม่ให้ความสามารถในการทำซ้ำที่เพียงพอ

การทำให้เป็นอนุพันธ์โดยการจุ่มช่วยให้เกิดการสร้างอนุพันธ์ที่เป็นเนื้อเดียวกันและทำซ้ำได้มากขึ้นแต่ต้องใช้น้ำยามากขึ้น นอกจากนั้นอาจมีสีพื้นหลังเกิดขึ้น ตรวจสอบให้แน่ใจว่าได้เช็ดบริเวณด้านหลังของแผ่นอย่างระมัดระวังหลังจากการสร้างอนุพันธ์และก่อนที่จะอ่านออก

วิธีการอ่านแผ่น TLC?

การดำเนินการ TLC ในทางที่เหมาะสมจะช่วยให้คุณได้ผลลัพธ์ที่ทำซ้ำได้และแม่นยำทั้งสำหรับการวิเคราะห์เชิงคุณภาพและเชิงปริมาณ

เราจะกล่าวถึงเคล็ดลับและเคล็ดลับเพิ่มเติมสำหรับกระบวนการสร้างภาพและเอกสารในบทความแยกต่างหาก

ผลิตภัณฑ์

ขออภัย เกิดข้อผิดพลาดที่ไม่คาดคิด

Response not successful: Received status code 500

ข้อมูลอ้างอิง

1. Snyder LR. 1978. Classification off the Solvent Properties of Common Liquids. Journal of Chromatographic Science. 16(6):223-234. https://doi.org/10.1093/chromsci/16.6.223