Microfluidics สำหรับ Nanoencapsulation ของกรดนิวคลีอิก

Friederike Adams^1,2, Olivia M. Merkel³

¹Chair of Macromolecular Materials and Fiber Chemistry, Institute of Polymer Chemistry, University of Stuttgart, Pfaffenwaldring 55, 70569 Stuttgart, Germany, ²Institute for Ophthalmic Research, University Eye Hospital Tübingen, Elfriede-Aulhorn-Strasse 7, 72076 Tübingen, Germany, ³Department of Pharmacy, Pharmaceutical Technology and Biopharmacy, Ludwig-Maximilians University Munich, 81377 Munich, Germany

Material Matters™, 2022, 17.2 | Material Matters™ Publications

[email protected]

บทนำ

ในทางตรงกันข้ามกับอนุภาคนาโนไขมัน (LNPs) ซึ่งมักเต็มไปด้วยกรดนิวคลีอิกโพลีซีเลชันเช่นโพลีเอมีนประกอบด้วยกรดนิวคลีอิกโพลีอานิคเป็นสารประกอบโพลีอิเล็กโทรไลต์ที่เรียกว่า (polyplexes) เนื่องจากการดึงดูดไฟฟ้าสถิต ข้อเสียของพวกเขาเมื่อเทียบกับ LNPs คือสัณฐานวิทยาและองค์ประกอบที่กำหนดไว้น้อยลงซึ่งได้รับการรายงานว่านำไปสู่การกระจายขนาดอนุภาคโพลีแยกย้ายกันและสูตรที่ทำซ้ำได้ไม่ดี¹ โดยการประกอบ microfluidic ของกรดนิวคลีอิก/คอมเพล็กซ์ผู้ให้บริการทั้งสองข้อเสียสามารถแก้ไขได้อย่างมีประสิทธิภาพสำหรับการกำหนดที่กำหนดและทำซ้ำ rna nanocarriers² สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับ microfluidics สำหรับการเตรียม LNPs เราขอแนะนำอ้างอิง 3 Amongst polyamines ใช้สำหรับการทำให้ผิว, polyethylenimine (PEI) และ poly-L-lysine (PLL) รวมทั้งอนุพันธ์ของพวกเขามีการใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุดสำหรับการใช้งาน preclinical นอกจากนี้โพลีอะมิ 2 โนมีน (PAMAM) dendrimers, poly (dimethylamino) ethyl methacrylate (PDMAEMA) หรือ polyamines ที่มีต้นกำเนิดจากธรรมชาติเช่น chitosan, cationic gelatin หรือ pullulan และเปปไทด์ที่อุดมด้วยอาร์จินีนได้รับการอธิบายสำหรับการก่อตัวของ polyplex⁴ polyamines ซึ่งได้รับการคัดเลือกในการศึกษาต่างๆสำหรับการประกอบ microfluidic ของ polyplexes กรดนิวคลีอิกจะแสดงใน รูปที่ 1 

Section Overview

• การผสม Microfluidic โดยใช้การโฟกัส Flow
• ชิปผสม Microfluidic พร้อมลูป
• Microfluidic Micromixer อื่นๆ
• วิธีการที่ใช้หยด
• ผลิตภัณฑ์
• ข้อมูลอ้างอิง

รูปที่ 1 แคไทออนิกพอลิเมอร์ที่ใช้สำหรับการผสม microfluidic กับกรดนิวคลีอิก สำหรับ dendrimers โพลี (amidoamine) (PAMAM) จะแสดงรุ่น PAMAM 2 For more information on PAMAM dendrimers, we refer to Reference 5.

การผสม Microfluidic โดยใช้การโฟกัส Flow

ระบบ microfluidic แรกที่มีตัวให้ประจุบวกสำหรับการห่อหุ้มกรดนิวคลีอิกถูกนำมาใช้ในปี 2009 เพื่อห่อหุ้มพลาสมามิดดีเอ็นเอ (PDNA) ใน PEI ที่มีความเข้มข้นสูง 25 กก./ โมล การผสมแบบ microfluidic ทำขึ้นเพื่อป้องกันการกระจายขนาดอนุภาคขนาดใหญ่ของคอมเพล็กซ์ DNA/PEI ที่เกิดจากการผสมเป็นกลุ่มแบบดั้งเดิมและเพื่อปรับปรุงลักษณะทั่วไปของอนุภาคความสามารถในการทำงานของเซลล์และการแสดงออกของยีน อุปกรณ์โฟกัสแบบไมโครไดนามิกแบบโพลี (เมธิล methacrylate) แบบง่ายถูกใช้ในอัตราการไหล 10 และ 50 µL/นาทีสำหรับกลาง (สารละลาย DNA) หรือช่องด้านข้าง (สารละลาย PEI) ตามลำดับ กระแส DNA ถูกโฟกัสแบบไฮโดรไดนามิกลงในกระแสที่แคบโดยกระแสด้าน PEI ทั้งสอง (รูปที่ 2)⁶

รูปที่ 2 A และ B) อุปกรณ์โฟกัสไฮโดรไดนามิกแบบ Microfluidic ที่มีสองช่องเข้าและช่องเสียบหนึ่งช่องสำหรับการเตรียมคอมเพล็กซ์ PDNA/PEI c) ฟลูออเรสเซนซ์ไมโครกราฟของรูปแบบการไหลโดยใช้สีย้อมฟลูออเรสเซีนและ Rhodamine ที่มีป้ายชื่อ PEI ทำซ้ำโดยได้รับอนุญาตจากอ้างอิง 6 ลิขสิทธิ์ 2009 สมาคมเคมีอเมริกัน

อุปกรณ์ microfluidic ที่เรียบง่ายคล้ายกันถูกนำมาใช้ในการศึกษาการประกอบด้วยตัวเองของดีเอ็นเอโพลีเพล็กซ์ภายใต้การไหลแบบลามินาร์ในเวลาจริงโดยใช้การศึกษาการถ่ายโอนพลังงานการสะท้อนแสงแบบควอนตัมจุดกลาง (QD-FRET) PDNA ถูกระบุด้วยจุดควอนตัมเป็นผู้บริจาค FRET และไคโตซานที่ผสมสีย้อม Cy5 ถูกนำมาใช้เป็นตัวรับประจุที่ย่อยสลายได้ปลอดสารพิษและเป็นตัวรับสาร FRET เนื่องจากการเก็บรักษาการไหลแบบ Laminar หลังจากรวมโซลูชันทั้งสองใน T-junction การผสมจะเกิดขึ้นที่อินเทอร์เฟซของทั้งสองสตรีมทำให้สามารถประกอบจลนศาสตร์ด้วยตนเองได้อย่างแม่นยำซึ่งตรวจสอบโดย FRET การตรวจจับการปล่อย Cy5 ยืนยันว่าการสร้างดีเอ็นเอ/ไคโตซานโพลีเพล็กซ์ประสบความสำเร็จ ตรวจพบการปล่อยไอเสียทันทีหลังจากรวมการไหลทั้งสองในจุดเชื่อมต่อรูปตัว T แสดงการโต้ตอบระหว่างดีเอ็นเอ/ผู้ให้บริการทันทีกับความเข้มข้นของโพลีเพล็กซ์ที่เพิ่มขึ้นเมื่อเวลาผ่านไป⁷

การโฟกัสการไหลแบบไฮโดรไดนามิกสามมิติถูกเลือกโดย Quinones-Hinojosa และคณะ เพื่อผลิตโพลี (β อะมิโนเอสเตอร์)/ดีเอ็นเอ polyplexes การประกอบการไหลอย่างต่อเนื่องของ polyplexes เหล่านี้ดำเนินการในอัตรา 100 มก./ ชม. โดยใช้อัตราการไหลสูง 45 มล./ ชม เพื่อเอาชนะปัญหาของการจัดเก็บโพลีเพรีซหรือโพลีเอสเตอร์ในระยะยาวในการแก้ปัญหาน้ำนาโนคอมเพล็กซ์ถูกทำให้แห้ง หลังจากสามเดือนของการจัดเก็บที่ -20°C อนุภาคเหล่านี้แสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพการถ่ายโอนที่คล้ายกันในเซลล์ glioblastoma แต่ในเมลาโนมาและเซลล์มะเร็งเต้านมการแสดงออกของยีนก็เปรียบได้กับโพลีพเลซที่เตรียมขึ้นใหม่เมื่ออนุภาคถูกเตรียมโดยใช้ microfluidics โดยการวิเคราะห์การติดตามอนุภาคนาโนของ polyplexes ที่เต็มไปด้วยพลาสมาที่ติดฉลาก Cy3 ผู้เขียนพยายามที่จะกำหนดความเข้มข้นของอนุภาคนาโนและจำนวน plasmids ต่ออนุภาค⁸

ชิปผสม Microfluidic พร้อมลูป

เพื่อเพิ่มปฏิสัมพันธ์ระหว่างโพลิเมอร์และสารละลายกรดนิวคลีอิกในช่อง microfluidic เครื่องผสมที่ใช้งานอยู่จะมีแผ่นกั้นที่ทำให้เกิดการไหลแบบปั่นป่วนที่ควบคุมได้มากกว่าการไหลแบบ Laminar ในตัวอย่างหนึ่ง Kissel et al. ตรวจสอบการก่อตัวของ PEI/PDNA polyplexes โดยใช้อุปกรณ์ microfluidic และ polyplexes ที่มี PEI ดัดแปลง (hyperbranched, 25 kg/mol และ 5 kg/mol) และ siRNA หรือ mRNA เป็นกรดนิวคลีอิก Polyplexes ได้รับการจัดเตรียมในการประกอบ microfluidic lab-on-a-chip โดยใช้อัตราการไหลที่แตกต่างกัน สารละลาย PEI และกรดนิวคลีอิกถูกสูบแยกออกเป็นชิปผสมที่ประกอบด้วยรูปทรงเรขาคณิตที่แตกต่างกันโดยมีความยาวและการออกแบบการผสมที่แตกต่างกัน ลักษณะการผสมในชิปที่แตกต่างกันได้รับการประเมินด้วยสารละลายทริปแพนบลูและคาร์บอกซีฟลูออเรสเซีน 5 (6) ภายใต้ไมโครสโคป เนื่องจากการออกแบบบางอย่างแสดงให้เห็นถึงการไหลแบบลามินาร์ของโซลูชันทั้งสองแม้หลังจากผ่านจุดเชื่อมต่อ Y โดยไม่มีการผสมที่ตามมาห่วงจึงจำเป็นต้องตามส่วน Y เพื่ออำนวยความสะดวกในการผสม PEI และ DNA เพื่อสร้างโพลีเพล็กเลสขนาดเล็กและสม่ำเสมอ ขนาดอนุภาคของ PEI/PDNA polyplexes ส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับอัตราส่วนระหว่างตัวนำประจุบวกและกรดนิวคลีอิก (อัตราส่วน N/P) ที่มีขนาดสม่ำเสมอที่ N/P = 5 – 20 และเป็นอิสระจากความเข้มข้นหรืออัตราการไหล⁹ 5 ต่อไปกลุ่มใช้ส่วนที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำกว่า 25 กก./ โมล PEI, 5 กก./ โมล PEI และ transferrin-PEI (0.5 กก./ โมล) สำหรับวิธีการกำหนดเป้าหมายเฉพาะร่วมกับ PDNA, siRNA และ mRNA สำหรับ PDNA ขนาดของโพลีเพล็กซ์นั้นคล้ายคลึงกันโดยไม่คำนึงถึงวิธีการเตรียมแต่ความหนาแน่นของโพลิซิติกต่ำกว่าสำหรับการผสม microfluidic เมื่อเทียบกับ pipetting วิธีการผสม microfluidic เดียวกันสามารถถ่ายโอนไปยังกรดนิวคลีอิกอื่นๆได้เนื่องจากมีโพลีเพเลซขนาดใกล้เคียงกับโพลิเมอร์เหล่านี้และ siRNA หรือ mRNA เกิดขึ้นโดยทั่วไปจะมีการสังเกตพบความหนาแน่นสูงขึ้นเมื่อใช้ siRNA⁹

กลุ่ม Kissel และ Merkel ประเมินโคพอลิเมอร์ PEI ที่ซับซ้อนมากขึ้น โคพอลิเมอร์ไตรบล็อกที่ไม่ละลายน้ำสะเทินน้ำสะเทินบกประกอบด้วยโพลีไฮโดรฟิลิก (Ethylene Glycol), โพลีที่ไม่ชอบน้ำ (caprolactone) และ PEI เชิงเส้น 2.5 กก./โมล (PEG-PCL-PEI) ถูกใช้เป็นผู้ให้บริการ SiRNA¹⁰ การผสม Microfluidic นำไปสู่อนุภาคที่เล็กที่สุดสม่ำเสมอและมีเสถียรภาพมากที่สุดเมื่อเทียบกับเทคนิคการทดสอบอื่นๆทั้งหมดเมื่อใช้สารละลายของ nanocarrier ที่เตรียมไว้ล่วงหน้าผ่านเทคนิคการกำจัดตัวทำละลายและสารละลายกรดนิวคลีอิกโดยใช้การตั้งค่า microfluidic เดียวกันที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดในการศึกษาก่อนหน้านี้ (vide supra) นอกจากนี้ยังมีการสังเกตพบประสิทธิภาพในการถ่ายโอนข้อมูลที่สูงขึ้นเล็กน้อยในเซลล์ SKOV3 สำหรับโพลีเพเลซเหล่านี้ซึ่งเพิ่มขึ้นจากร้อยละ 24 8 (โพลีเพเลสผ่านท่อ) เป็นร้อยละ 5 34¹⁰ Merkel และคณะ พัฒนาการศึกษาเหล่านี้เพิ่มเติมโดยใช้โพลิเมอร์ PEG-PCL-PEI ที่ละลายน้ำได้ของ PEI ที่มีความเข้มข้นสูง 25 กก./ โมล PEI ชิป Dolomite micromixer ถูกนำมาใช้ซึ่งพอลิเมอร์และสารละลาย SiRNA ถูกสูบเข้าไปในชิปด้วยอัตราการไหล 0.5 มล./นาที (รูปที่ 3) ด้วยอัตราการไหลที่ต่ำที่สุดของเครื่องที่ผ่านการทดสอบทั้งสามเครื่องนี้โพลีพเลซมีขนาดเพียงครึ่งหนึ่งของเครื่องที่เตรียมไว้โดยการผสมแบบเทกองกับการกระจายขนาดที่แคบกว่า ในขณะที่ขนาดที่เล็กกว่าไม่ได้ส่งผลให้เกิดประโยชน์ใดๆเกี่ยวกับ การผ่าตัดเปลี่ยนถ่ายในหลอดทดลองแต่ก็แสดงให้เห็นอย่างชัดเจนว่าโพลีพเลซเหล่านี้ถูกนำมาใช้อย่างมีประสิทธิภาพมากขึ้น ใน การเลี้ยงลูกด้วยปอดหลังจากที่ได้รับการรักษาภายในร่างกายในการให้ยา Vivo ซึ่งได้รับการกล่าวถึงเนื่องจากการกวาดล้างที่มีประสิทธิภาพน้อยกว่าโดย macrophages ในปอด 2 กลุ่มเดียวกันแสดงให้เห็นว่าการตั้งค่านี้มีประสิทธิภาพกระตุ้นเซลล์มะเร็งปอดให้ cisplatin โดยใช้ sirNA ที่กำหนดเป้าหมายเป็น ERCC1 และ XPF หลังจากลดความสำคัญของสองเส้นทางที่มีประสิทธิภาพมากที่สุดที่ซ่อมแซมความเสียหายดีเอ็นเอที่เกิดจากแพลตตินัมโดย 80 – 50% ในเซลล์มะเร็งปอดชนิด p53 ความไว IC50 ต่อ Cisplatin ลดลงตามปัจจัย 90 2¹¹

รูปที่ 3 ภาพวาดแผนผังของการผสม microfluidic ของ PEI และ SiRNA โดยใช้ชิป Dolomite Micromixer ทำซ้ำโดยได้รับอนุญาตจากการอ้างอิง 2 ลิขสิทธิ์ 2017 การเผยแพร่ IOP

ระบบที่ซับซ้อนมากขึ้นซึ่ง cationic 2.5 kg/mol PEI-β -cyclodextrin (PEI-CD), hyaluronic acid-adamantane (HA-Ad) และ PDNA ถูกผสมในเครื่องปฏิกรณ์ขนาดเล็ก Chemtrix เชิงพาณิชย์ได้รับการพัฒนาโดย Thompson et al. ใช้วิธีการแบบเลเยอร์ต่อเลเยอร์ (รูปที่ 4) PEI-CD และ PDNA ได้รับการประกอบผ่านสองช่องเข้าที่อัตราส่วน N/P 10 20 หรือ 30 และอัตราการไหล PDNA เท่ากับ 5 10 หรือ 20 µL/นาที หลังจากการประกอบด้วยตัวเอง HA-Ad ถูกเพิ่มเข้าไปในช่องเข้าแยกต่างหากที่ปลายชิปผสม HA-Ad ถูกใช้เนื่องจากความสามารถในการละลายน้ำความสามารถในการกำหนดเป้าหมาย CD44 และความเข้ากันได้ทางชีวภาพเพื่อทำหน้าที่เป็นเปลือกป้องกัน อัตราการไหลที่สูงขึ้นนำไปสู่อนุภาคขนาดเล็กที่มีการกระจายขนาดแคบลงและมีศักยภาพ Zeta ต่ำกว่าเมื่อเทียบกับขั้นตอนการผสมจำนวนมากที่คล้ายกัน อย่างไรก็ตามการศึกษาความเสถียรของโพลีเพล็กซ์กับ PicoGreen ระบุว่าโพลีเพล็กซ์ที่เตรียมโดยการผสมการไหลมีเสถียรภาพน้อยกว่าในการปรากฏตัวของเฮปารินเป็นโพลีแอนที่แข่งขันกันและมีความไวต่อการถอดชิ้นส่วนมากขึ้น ความเสถียรที่ลดลงเมื่อใช้ร่วมกับ Zeta potentials ที่ลดลงถูกตั้งสมมติฐานว่าทำให้เกิดประสิทธิภาพในการถ่ายโอนลดลงสำหรับคอมเพล็กซ์ผสมการไหลในมือข้างหนึ่งโดยมีความเป็นพิษต่อเซลล์ลดลงในมืออีกข้างหนึ่ง¹²

ในวิธีการสองขั้นตอนที่คล้ายกัน, Moffitt et al. ศึกษาการประกอบตัวเองของ cationic poly (vinylpyridine) 2 - บล็อกโพลี (ε -caprolactone) (P2VP-PCL) ด้วย PDNA ตามด้วยการประกอบที่สองด้วย micellar poly (ethylene glycol) - บล็อกโพลี (ε -caprolactone) (PEG-PCL) ส่งผลให้เกิด "polyplex-in-hydrophobic core" (PIHC) micelles เทคนิค microfluidic ใช้สำหรับขั้นตอนการประกอบที่สองเพื่อควบคุมการผสมน้ำและไดออกเซนด้วยการแก้ปัญหาของโพลีเพล็กซ์ P2VP-PCL/PDNA ที่ประกอบไว้ก่อนหน้านี้รวมกับโพลิเมอร์ PEG-PCL แล้ว¹³

รูปที่ 4 Chemtrix microreactor (Design 1) ที่มีช่องเข้า 3023 ช่องและช่องเสียบหนึ่งช่องสำหรับการก่อตัวของ PEI-CD, PDNA polyplexes ที่ประกอบเข้ากับ HA-Ad ต่อไป พิมพ์ซ้ำโดยได้รับอนุญาตจากบุคคลอ้างอิง 14 ลิขสิทธิ์ 2022 Chemtrix BV

Microfluidic Micromixer อื่นๆ

Polyplexes ที่มี PEI เชิงเส้น 22 กก./โมลและ PDNA ได้รับการเตรียมด้วยเครื่องผสมขนาดเล็กที่ความเร็วที่แตกต่างกันเพื่อตรวจสอบผลกระทบของความเร็วในการผสมกับลักษณะโพลีเพล็กซ์ ไมโครมิกเซอร์ที่ปรับขนาดขึ้นประกอบด้วยปั๊มฉีดยาสองตัวที่สูบน้ำ PEI และสารละลาย DNA เข้าไปในการเชื่อมต่อรูปตัว T แบบเดิมซึ่งมักใช้เป็นตัวเชื่อมต่อในการวิเคราะห์ HPLC ความเร็วที่แตกต่างกันและความเข้มข้นของพลาสมิดถูกตั้งค่าเพื่อตรวจสอบอิทธิพลต่อการก่อตัวของโพลีเพล็กซ์ อัตราการผสมที่เพิ่มขึ้นและความเข้มข้นของ DNA ที่ลดลงทำให้ขนาดของอนุภาคลดลงและทำซ้ำได้ (ต่ำถึง 50 nm) และความหนาแน่นของโพลีดิสพอลิออนต่ำเป็นพิเศษที่ 0.05 อย่างไรก็ตามกิจกรรมการเผาผลาญอาหารและการถ่ายโอน ในหลอดทดลอง ไม่มีความแตกต่างระหว่างโพลีพเลสที่เตรียมผ่านการผสมขนาดเล็กหรืออนุภาคที่แตกต่างกันมากขึ้นที่เตรียมโดยการวางท่อในปริมาณมาก¹⁵

การตั้งค่าที่ซับซ้อนมากขึ้นได้รับการตรวจสอบโดย Foged et al. ซึ่งช่องเข้าสามช่องเชื่อมต่อกับเครื่องผสมขนาดเล็ก กระบอกฉีดยาหนึ่งกระบอกพร้อมสารละลาย SiRNA ในช่องเข้ากลางและกระบอกฉีดยาสองกระบอกพร้อมด้วยเครื่องอัดเม็ดยารุ่น 4 PAMAM ในช่องเข้าด้านนอกถูกสูบเข้าไปในเครื่องผสมขนาดเล็กที่พิมพ์ด้วย 3 มิติเพื่อสร้างโพลีเพเลส ไมโครมิกเซอร์ที่ปรับแต่งได้รับการออกแบบตามรูปแบบการไหลที่ต้องการหลังจากทำการศึกษาจำลอง การทดสอบอัตราการไหลที่แตกต่างกันอัตราการไหลที่เพิ่มขึ้นนำไปสู่อนุภาคขนาดเล็ก อย่างไรก็ตามขนาดและความหนาเหล่านี้ไม่ได้รับการปรับปรุงเมื่อเทียบกับการผสมเป็นกลุ่มที่อัตราส่วน N/P เท่ากับ 20 หลังจากนั้น polyplexes เหล่านี้ถูกถ่ายโอนไปยังผงอนุภาคขนาดเล็กผ่านการพ่นแห้งเพื่อการรักษาด้วยการสูดดม มีการใช้ saccharides ที่แตกต่างกันในระหว่างกระบวนการอบแห้งแบบสเปรย์เพื่อให้ได้อนุภาคขนาดเล็กแบบนาโนฝัง (NEM) อัตราส่วนนาโนคอมเพล็กซ์ต่อเมทริกซ์ (N/M) หลายตัวได้รับการทดสอบด้วยสารเพิ่มปริมาณทั้งหมด ได้รับอนุภาคทรงกลมที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางอนุภาคอากาศพลศาสตร์ 5 μ m ที่มีความชื้นตกค้างระหว่าง 0.2 (µm รับ mannitol) และ 6 wt.% (สำหรับ trehalose) ความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์ RAW264.7 ได้รับผลกระทบเพียงเล็กน้อยจากนาโนคอมเพล็กซ์ที่ความเข้มข้น SiRNA สูงถึง 40 0 นาโนเมตร การดูดเซลล์ของ NEM ในสายเซลล์เดียวกันได้รับการตรวจสอบผ่านทางกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลโดยใช้หลอดฟลูออเรสเซนต์ SiRNA และการไหลของ cytometry แสดงการดูดเซลล์สูงสุดสำหรับ NEM ที่มีส่วนผสมของ trehalose/inulin 50/50 นอกจากนี้ NEM นี้ α ให้เกิดการยับยั้งการแสดงออก TNF-F 87% ในการทดลองการเงียบของยีนซึ่งอยู่ในช่วงเดียวกันกับ nanocomcomplexes ที่เตรียมขึ้นใหม่โดยไม่ต้อง excipient ผลกระทบเฉพาะของการผสม microfluidic เพียงอย่างเดียวต่อประสิทธิภาพการถ่ายเลือดไม่ได้รับการตรวจสอบในการศึกษานี้¹⁶

วิธีการที่ใช้หยด

โดยการใช้สารพาความร้อนที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ jetpei^®ซึ่งเป็น อนุพันธ์ polyethylenimine เชิงเส้น 2 0 กก./โมลหรือ Turbofect (โพลี (โพลี 2 hydroxypropylenimine)) และ PDNA ใน microfluidics-Assisted คุมขัง (MAC) Leong et al. สามารถผลิตหยด picoliter ซึ่งประกอบด้วยนาโนคอมเพล็กซ์ที่กำหนดไว้อย่างดี หยดถูกผลิตขึ้นในเครื่องกำเนิดหยด microfluidic แบบครอสโฟลว์ผ่านการไหลที่แข่งขันกันของเฟสน้ำมันอย่างต่อเนื่องและกระจายเฟสน้ำ พลาสมิดดีเอ็นเอ, PEI และสารละลายบัฟเฟอร์ถูกฉีดเข้าไปในแต่ละช่องโดยใช้ปั๊มฉีดยา DNA และโซลูชันของผู้ให้บริการถูกจำกัดอยู่ในหยดแต่ละตัวและถูกผสมในช่องคดเคี้ยวเพื่อสร้างนาโนคอมเพล็กซ์ผ่านการปฏิสัมพันธ์ของไฟฟ้าสถิต (รูปที่ 5) โซลูชันบัฟเฟอร์ถูกใช้เพื่อหลีกเลี่ยงการรวม Polyplexes ที่เกิดขึ้นผ่านทางวิธีนี้แสดงให้เห็นถึงเส้นผ่าศูนย์กลาง monodisperse มากขึ้นด้วยความเป็นกลางมากขึ้นเล็กน้อย Zeta ศักยภาพและความมั่นคงนาโนคอมเพล็กซ์ที่เพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับการผสมจำนวนมากที่บ่งชี้ถึงการห่อหุ้มที่ดีที่สุดของ PDNA และความต้านทานต่อการรวม หลังจากการบ่มด้วยเซลล์ HEK293 โพลีเพล็กที่เกิดขึ้นผ่าน microfluidics แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการเพิ่มขึ้นของเซลล์สำหรับโพลิเมอร์และการถ่ายโอนที่ดีขึ้นเล็กน้อยเมื่อใช้ Turbofect มันแสดงให้เห็นว่า polyplexes ขนาดใหญ่ที่เป็นผลมาจากการผสมจำนวนมากบางส่วนแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพการดูดซึมที่สูงขึ้นในช่วงต้นเวลาแต่ปรับระดับออก ในทางตรงกันข้ามอนุภาคที่ผลิตด้วย MAC ที่มีขนาดเล็กและมีเสถียรภาพมากขึ้นจะมีการดูดที่สม่ำเสมอมากขึ้น¹⁷ การตรวจสอบนี้สอดคล้องกับสมมติฐานที่ว่าอนุภาคขนาดใหญ่ที่มีตะกอนเร็วขึ้นและอาจส่งผลให้การดูดซึมมีประสิทธิภาพ² โดยเฉพาะอย่างยิ่งในช่วงต้นจุด¹⁷ กำบังประโยชน์ที่อาจเกิดขึ้นของการผสม microfluidic¹⁵

กลุ่มเดียวกันตรวจสอบการประกอบตัวเองของโพลี biorducible (amido amines) ด้วย PDNA หรือ mRNA ในอุปกรณ์ microfluidic เดียวกัน มีการสังเกตลักษณะของอนุภาคนาโนที่ดีขึ้น (เล็กลงสม่ำเสมอมากขึ้นรวมน้อยลง) QD-FRET และ cytometry การไหลถูกนำมาใช้ในการวัดปริมาณการเปิดตัวภายในเซลล์ของ polyplexes และการปล่อยดีเอ็นเอ DNA polyplexes ที่ผลิตโดย MAC แสดงให้เห็นถึงความเสถียรในการคอลลอยด์และการยึดเกาะที่เพิ่มขึ้นและการถ่ายโอนข้อมูลได้รับการปรับปรุงในสายเซลล์ต่างๆ (HEK293 fibroblasts ตัวอ่อนของเมาส์หลักเซลล์ต้นกำเนิด mesenchymal มนุษย์และเซลล์มะเร็งตับตับของมนุษย์ HepG2) ประสิทธิภาพที่สูงขึ้นเหล่านี้เกิดจากการปล่อยเพย์โหลดอย่างค่อยเป็นค่อยไปตามที่ QD-FRET ตรวจสอบ¹⁸

รูปที่ 5 การประกอบ microfluidic ของโพลีเพเลส PDNA ในหยด picoliter โดยใช้เครื่องกำเนิดหยดแบบ crosflow ทำซ้ำโดยได้รับอนุญาตจากอ้างอิง 17 ลิขสิทธิ์ 2011 สมาคมเคมีอเมริกัน

เฉินและคณะ ได้รับการออกแบบอุปกรณ์ microfluidic ที่ใช้หยดที่คล้ายกันควบคู่ไปกับการตั้งค่า dielectrophoresis (DEP) เพื่อจัดเรียงนาโนคอมเพล็กซ์พอลิเมอร์ /PDNA โดยตรงจากระยะน้ำมันในสนามไฟฟ้าที่ไม่สม่ำเสมอ ในฐานะที่เป็นผู้ให้บริการประจุบวกมีการใช้กรดไขมันในระดับโมเลกุลต่ำ cyclodextrin-PEI (600 g/mol) ซึ่งมีประสิทธิภาพในการถ่ายโอนสูงและมีความเป็นพิษต่อเซลล์ต่ำในการศึกษาก่อนหน้านี้ DEP ลดลงอีก polydispersity และขนาดของ polyplexes เมื่อเทียบกับชุดผสม/pipetting และบนชิปผสมโดยไม่ต้อง DEP ประสิทธิภาพการถ่ายโอนอ้างว่าเพิ่มขึ้นโดยการผสม DEP ได้รับการประเมินโดยการนับด้วยกล้องจุลทรรศน์ของเซลล์ฟลูออเรสเซนต์แต่ไม่มีการแสดงผลเชิงปริมาณ¹⁹

สรุป

การผสม microfluidic ช่วยให้สามารถควบคุมการประกอบของ polyplexes กรดนิวคลีอิกซึ่งในหลายบัญชีได้รับรายงานว่ามีประโยชน์ต่อขนาด polyplex และ polydispersity เกี่ยวกับประสิทธิภาพภาพไม่ชัดเจนซึ่งอาจเป็นผลมาจากการศึกษาส่วนใหญ่ที่ตรวจสอบเฉพาะการผ่าตัด เปลี่ยนถ่ายในหลอดทดลอง ตามที่ชี้ให้เห็นการดูดซึมจลนศาสตร์ขึ้นอยู่กับขนาดอนุภาคในการตั้งค่าวัฒนธรรมเซลล์สองมิติทั่วไป อนุภาคขนาดใหญ่ที่ตะกอนเร็วขึ้นอาจปกปิดผลประโยชน์ที่อาจเกิดขึ้นซึ่งอนุภาคขนาดเล็กมีในระยะยาว ใน การศึกษาในร่างกายการกวาดล้างของอนุภาคขนาดใหญ่โดยเซลล์ phagocytosing มีบทบาทสำคัญมากขึ้นดังนั้นความแตกต่างสามารถแสดงได้ชัดเจนยิ่งขึ้น โดยรวมแล้วเงื่อนไขการผสม microfluidic จะต้องได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับแต่ละระบบการผสมและอาจได้รับผลกระทบจากวัสดุและตัวทำละลายที่ใช้ อย่างไรก็ตามข้อได้เปรียบที่สำคัญที่สุดคือความสามารถในการทำซ้ำและปรับขนาดกระบวนการผลิต 

Acknowledgment

Württemberg ขอบคุณสำหรับเงินทุนจากกระทรวงการศึกษาและการวิจัยของรัฐบาลกลาง (BMBF) และกระทรวงวิทยาศาสตร์ Baden-W ü วิจัยและศิลปะเป็นส่วนหนึ่งของกลยุทธ์ความเป็นเลิศของรัฐบาลกลางและรัฐบาลของรัฐเยอรมัน O.M.M. ยอมรับการสนับสนุนจากสภาวิจัยยุโรป (ERC- 2014 - STG - 637830) จากมูลนิธิวิจัยบาวาเรีย (AZ- 1449 - 20 C) และจากศูนย์นาโนวิทยาศาสตร์ที่ LMU มิวนิค

ข้อมูลอ้างอิง

1. Kozielski KL, Tzeng SY, Hurtado De Mendoza BA, Green JJ. 2014. Bioreducible Cationic Polymer-Based Nanoparticles for Efficient and Environmentally Triggered Cytoplasmic siRNA Delivery to Primary Human Brain Cancer Cells. ACS Nano. 8(4):3232-3241. https://doi.org/10.1021/nn500704t

2. Feldmann DP, Xie Y, Jones SK, Yu D, Moszczynska A, Merkel OM. 2017. The impact of microfluidic mixing of triblock micelleplexes on in vitro $/$ in vivo gene silencing and intracellular trafficking. Nanotechnology. 28(22):224001. https://doi.org/10.1088/1361-6528/aa6d15

3. Ali MS, Hooshmand N, El-Sayed M, Labouta HI. Microfluidics for Development of Lipid Nanoparticles: Paving the Way for Nucleic Acids to the Clinic. ACS Appl. Bio Mater.. https://doi.org/10.1021/acsabm.1c00732

4. Merkel OM, Kissel T. 2014. Quo vadis polyplex?. Journal of Controlled Release. 190415-423. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2014.06.009

5. Boas U, Christensen JB, Heegaard PMH. 2006. Dendrimers: design, synthesis and chemical properties. J. Mater. Chem.. 16(38):3785. https://doi.org/10.1039/b611813p

6. Koh CG, Kang X, Xie Y, Fei Z, Guan J, Yu B, Zhang X, Lee LJ. 2009. Delivery of Polyethylenimine/DNA Complexes Assembled in a Microfluidics Device. Mol. Pharmaceutics. 6(5):1333-1342. https://doi.org/10.1021/mp900016q

7. Ho Y, Chen HH, Leong KW, Wang T. 2009. The convergence of quantum-dot-mediated fluorescence resonance energy transfer and microfluidics for monitoring DNA polyplex self-assembly in real time. Nanotechnology. 20(9):095103. https://doi.org/10.1088/0957-4484/20/9/095103

8. Wilson DR, Mosenia A, Suprenant MP, Upadhya R, Routkevitch D, Meyer RA, Quinones?Hinojosa A, Green JJ. 2017. Continuous microfluidic assembly of biodegradable poly(beta?amino ester)/DNA nanoparticles for enhanced gene delivery. J. Biomed. Mater. Res.. 105(6):1813-1825. https://doi.org/10.1002/jbm.a.36033

9. Debus H, Beck-Broichsitter M, Kissel T. 2012. Optimized preparation of pDNA/poly(ethylene imine) polyplexes using a microfluidic system. Lab Chip. 12(14):2498. https://doi.org/10.1039/c2lc40176b

10. Endres T, Zheng M, Beck-Broichsitter M, Samsonova O, Debus H, Kissel T. 2012. Optimising the self-assembly of siRNA loaded PEG-PCL-lPEI nano-carriers employing different preparation techniques. Journal of Controlled Release. 160(3):583-591. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2012.04.013

11. Feldmann DP, Heyza J, Zimmermann CM, Patrick SM, Merkel OM. Nanoparticle-Mediated Gene Silencing for Sensitization of Lung Cancer to Cisplatin Therapy. Molecules. 25(8):1994. https://doi.org/10.3390/molecules25081994

12. Kulkarni A, VerHeul R, DeFrees K, Collins CJ, Schuldt RA, Vlahu A, Thompson DH. 2013. Microfluidic assembly of cationic-?-cyclodextrin:hyaluronic acid-adamantane host:guest pDNA nanoparticles. Biomater. Sci.. 1(10):1029. https://doi.org/10.1039/c3bm00189j

13. Kly S, Andrew LJ, Moloney EG, Huang Y, Wulff JE, Moffitt MG. 2021. Hierarchical Self-Assembly Route to ?Polyplex-in-Hydrophobic-Core? Micelles for Gene Delivery. Chem. Mater.. 33(17):6860-6875. https://doi.org/10.1021/acs.chemmater.1c01695

14. Chemtrix Labtrix - Flow Chemistry Method Development. . [Internet]. Available from: https://siteassets.pagecloud.com/proteaf/downloads/Brochure_Labrix-ID-0b4b0a25-f2ab-4c40-8637-1ec275be4897.pdf

15. Kasper JC, Schaffert D, Ogris M, Wagner E, Friess W. 2011. The establishment of an up-scaled micro-mixer method allows the standardized and reproducible preparation of well-defined plasmid/LPEI polyplexes. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77(1):182-185. https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2010.11.012

16. Agnoletti M, Bohr A, Thanki K, Wan F, Zeng X, Boetker JP, Yang M, Foged C. 2017. Inhalable siRNA-loaded nano-embedded microparticles engineered using microfluidics and spray drying. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 1209-21. https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2017.08.001

17. Ho Y, Grigsby CL, Zhao F, Leong KW. 2011. Tuning Physical Properties of Nanocomplexes through Microfluidics-Assisted Confinement. Nano Lett.. 11(5):2178-2182. https://doi.org/10.1021/nl200862n

18. Grigsby CL, Ho Y, Lin C, Engbersen JFJ, Leong KW. 2013. Microfluidic Preparation of Polymer-Nucleic Acid Nanocomplexes Improves Nonviral Gene Transfer. Sci Rep. 3(1): https://doi.org/10.1038/srep03155

19. Yang S, Yao H, Zhang D, Li WJ, Kung H, Chen S. 2015. Droplet-based dielectrophoresis device for on-chip nanomedicine fabrication and improved gene delivery efficiency. Microfluid Nanofluid. 19(1):235-243. https://doi.org/10.1007/s10404-015-1560-x