Cell Culture Protocol 10: การทดสอบเซลล์สำหรับการปนเปื้อนของ Mycoplasma โดยการย้อมสี Hoechst DNA

ECACC Laboratory Handbook 4th Edition

เล็ง

วิธีการย้อมสี DNA เช่น  เทคนิคการย้อมสีโดยอ้อมของ Hoechs นั้นรวดเร็วพร้อมผลลัพธ์ที่มีอยู่ภายใน 72 ชั่วโมงซึ่งเปรียบเทียบได้ดีกับ  การแยกวัฒนธรรม rmycoplasma 4 สัปดาห์ การย้อมสี o fcell สาย ตรงกับคราบ DNA สามารถให้ผลลัพธ์ใน 24 ชั่วโมงอย่างไรก็ตามในความไวที่ลดลงมาก (~ 10 6 cfu/mL) ซึ่งอาจได้รับการปรับปรุงโดยการร่วมสร้างเส้นเซลล์ทดสอบในที่ที่มีเส้นเซลล์ตัวบ่งชี้เช่น Vero ขั้นตอนการเพิ่มปริมาณเชื้อนี้ส่งผลให้เกิดความไวต่อวัฒนธรรม 100 cfu/mL และเป็นวิธีที่ ECACC ใช้เป็นอันดับแรก ขั้นตอนนี้ยังช่วยเพิ่มความไวโดยการเพิ่มพื้นที่ผิวที่ mycoplasma สามารถติดได้ เช่นเดียวกับการตรวจจับโดยวัฒนธรรมวิธีการย้อมสี DNA เหมาะสำหรับการตรวจจับ mycoplasma จากวัฒนธรรมของเซลล์หรือตัวทำปฏิกิริยาเพาะเลี้ยงเซลล์

วัสดุ

• สื่อการเพาะเลี้ยงเซลล์: อุ่นเครื่องไว้ก่อนที่อุณหภูมิที่เหมาะสม (โปรดดูแผ่นข้อมูลสายเซลล์ ECACC สำหรับสื่อและอุณหภูมิที่ถูกต้อง)
• เมทานอล (322415)
• กรดอะซิติกน้ำแข็ง (A6283)
• Hoechst 33342 สารละลายคราบ (B2261)
• เซลล์ตัวบ่งชี้เช่น Vero Cells (84113001)
  - Mycoplasma hyorhinis NCTC10130 และ
  - Mycoplasma orale NCTC 10112

อุปกรณ์

• อุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคล (ถุงมือปลอดเชื้อ, เสื้อโค้ทในห้องปฏิบัติการ, หมวกนิรภัย)
• Waterbath set to 37 °C
• ตู้ความปลอดภัยทางจุลชีววิทยาของระดับการกักเก็บที่เหมาะสม
•  ชุดบ่มเชื้อ CO 2 ที่อุณหภูมิ 37°C
• ไมโครสโคป (UV Epi-Fluorescence)
• จานเพาะเชื้อเนื้อเยื่อ
• หลายจาน 12 ดี
• สไลด์ไมโครสโคปและภาพเต็ม 13 มม
• อลูมิเนียมฟอยล์

ขั้นตอน

1. วางฝาครอบที่ปราศจากเชื้อในจานเพาะเชื้อ/จานเพาะเชื้อเช่นแผ่นกันกระแทก 12 แผ่น
2. เติมเซลล์ตัวบ่งชี้ 2 มล. ลงในจานที่เตรียมไว้เช่น 2 x 10⁴ Vero Cells ต่อหลุม 12 แผ่นดี
3. บ่มเชื้อที่อุณหภูมิ 37°C ใน CO 5 2 10% เป็นเวลา 2-24 ชั่วโมงเพื่อให้เซลล์ยึดติดกับใบปะหน้า
4. นำสายเซลล์ทดสอบที่ติดอยู่ไปไว้ในระบบกันสะเทือนโดยใช้ตัวขูดเซลล์ สายเซลล์ระบบกันสะเทือนอาจได้รับการทดสอบโดยตรง
5. ลบ 1 มล. ของสารลอยตัวทางวัฒนธรรมจากหลุมที่ซ้ำกันและเพิ่ม 1 มล. ของตัวอย่างการทดสอบในแต่ละ ฉีดเชื้อ 2 หลุมด้วย 100 cfu ของแต่ละสิ่งมีชีวิตควบคุมบวก
6. ปล่อยให้หลุมวัฒนธรรมเนื้อเยื่อซ้ำกันไม่ได้ฉีดเป็นการควบคุมเชิงลบ
7. บ่มอาหารที่อุณหภูมิ 37°C ใน 5% CO2 เป็นเวลา 3-5 วัน
8. หลังจากผ่านไป 3-5 วันให้ยึดเซลล์ไว้ด้วยการเติม Carnoy’ s fixative อย่างน้อย 2 มล. (1:3 กรดอะซิติกน้ำแข็ง: เมทานอลสัมบูรณ์) ลงในแต่ละจานและทิ้งไว้ 3 นาที จากนั้นจึงเปลี่ยนเป็นขวดขยะที่เป็นพิษ ทำซ้ำอีกครั้ง เพิ่มอย่างน้อย 2 มล. รอยเปื้อน Hoechst 0.4μg/nl ทิ้งไว้ 3 นาทีเพื่อป้องกันแสงโดยตรงเช่นโดยการปิดด้วยอลูมิเนียมฟอยล์
9. Decant ใช้และไม่ได้ใช้คราบเพื่อขยะพิษ
10. ใส่สารยึด 1 หยดลงในสไลด์ไมโครสโคปที่ติดฉลากไว้แล้วและวางโคเวอร์ลิป (ด้านเซลล์คว่ำลง) ลงบนสไลด์
11. ปิดสไลด์ด้วยแผ่นอลูมิเนียมฟอยล์เพื่อให้สามารถตั้งค่าได้อย่างน้อย 15 นาทีที่อุณหภูมิ 37°C หรือ 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง
12. สังเกตสไลด์ใต้ UV Epi-Fluorescence ที่ 100 x

เกณฑ์สำหรับผลลัพธ์ที่ถูกต้อง

การควบคุมเชิงลบไม่แสดงหลักฐานของการติดเชื้อ mycoplasma; การควบคุมเชิงบวกแสดงหลักฐานของการติดเชื้อ mycoplasma; เซลล์ Vero เห็นได้ชัดว่าเป็นนิวเคลียสเรืองแสง

เกณฑ์สำหรับผลลัพธ์ที่เป็นบวก

ตัวอย่างที่ติดเชื้อ mycoplasma จะถูกมองว่าเป็นนิวเคลียสเรืองแสงบวกกับการเรืองแสงนิวเคลียร์พิเศษของดีเอ็นเอ mycoplasma (cocci ขนาดเล็กหรือเส้นใย)

เกณฑ์สำหรับผลลัพธ์ที่เป็นลบ

ตัวอย่างที่ไม่ติดเชื้อจะถูกมองว่าเป็นนิวเคลียสเรืองแสงกับพื้นหลังสีเข้ม ไม่ควรมีหลักฐานของ mycoplasma เช่นการเรืองแสงนิวเคลียร์พิเศษของดีเอ็นเอ mycoplasma

หมายเหตุ

1. รอยเปื้อน DNA เช่นรอยเปื้อนของ Hoechst จะเชื่อมกับ DNA โดยเฉพาะ ในทุกวัฒนธรรมนิวเคลียสของเซลล์จะเรืองแสง ในทางทฤษฎีวัฒนธรรมที่ไม่มีการปนเปื้อนจะแสดงเฉพาะนิวเคลียสเรืองแสงในขณะที่วัฒนธรรมบวก mycoplasma มี cocci ขนาดเล็กหรือเส้นใยซึ่งอาจหรืออาจจะไม่ได้รับการดูดซับลงบนเซลล์ (รูปที่ 11) อย่างไรก็ตามโปรดทราบว่าดีเอ็นเอที่ไม่เกี่ยวข้องใดๆจะมีการเรืองแสงเช่นเศษเซลล์ - ซึ่งบางครั้งเข้าใจผิดว่ามีการปนเปื้อน mycoplasma
2. คราบ Hoechst เป็นพิษและควรได้รับการจัดการและทิ้งด้วยความระมัดระวัง
3. ในบางกรณีผลลัพธ์อาจตีความได้ยากด้วยเหตุผลต่อไปนี้:
   •การปนเปื้อนของแบคทีเรีย/ยีสต์/เชื้อรา
   •เศษวัสดุมากเกินไปในพื้นหลัง (เช่นในกรณีของสายเซลล์ไฮบริดจ์)
   •นิวเคลียสที่แตกเนื่องจากเซลล์ทั้งหมดตายแล้ว
   •เซลล์ที่มีชีวิตน้อยเกินไปหรือไม่มีเซลล์
4. แม้ว่าขั้นตอนนี้จะแนะนำให้ใช้การควบคุมเชิงบวกแต่อาจไม่จำเป็นต้องเป็นไปได้หรือเป็นที่ต้องการในสถานที่เพาะเลี้ยงเซลล์ที่มีทรัพยากรจำกัด หากต้องใช้การควบคุมเชิงบวกควรดำเนินการในห้องปฏิบัติการแยกต่างหากจากสถานที่เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหลัก หากไม่ได้ใช้การควบคุมเชิงบวกขอแนะนำให้คุณใช้ห้องปฏิบัติการทดสอบอิสระเพื่อทดสอบสายเซลล์ของคุณเป็นระยะ
5. ECACC ขอแนะนำให้ทดสอบตัวอย่างสำหรับ mycoplasma โดยใช้วิธีการตรวจจับอย่างน้อยสองวิธี (เช่นการตรวจหารอยเปื้อน DNA ทางอ้อมและการแยกวัฒนธรรม) เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่น่าเชื่อถือยิ่งขึ้น เนื่องจากความไวในการตรวจจับที่แตกต่างกันของวิธีการสำหรับ mycoplasma ชนิดต่างๆ

ECACC มีบริการทดสอบ mycoplasma ซึ่งมีวิธีการตรวจจับที่แตกต่างกันสามวิธีได้แก่ PCR, คราบ DNA ทางอ้อมและการแยกวัฒนธรรม