[ข้ามไปยังเนื้อหา](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [![Merck](https://www.sigmaaldrich.com/static/logos/purple/merck.svg)](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th) สินค้า รถเข็น0 THTH สินค้า [เข้าสู่ระบบ / ลงทะเบียน](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [ค้นหาคำสั่งซื้อ](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/order-lookup) [สั่งซื้อด่วน](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/quick-order) รถเข็น0 [หน้าแรก](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th)[การตรวจหา*ไมโคพลาสมา*ในอุตสาหกรรมยา](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/applications/microbiological-testing/mycoplasma-testing)Cell Culture Protocol 10: การทดสอบเซลล์สำหรับการปนเปื้อนของ Mycoplasma โดยการย้อมสี Hoechst DNA # Cell Culture Protocol 10: การทดสอบเซลล์สำหรับการปนเปื้อนของ Mycoplasma โดยการย้อมสี Hoechst DNA *ECACC Laboratory Handbook 4th Edition* ## เล็ง ![วิธีการย้อมสี DNA](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/microbiological-testing/mycoplasma-testing/dna-staining.jpg "วิธีการย้อมสี DNA") วิธีการย้อมสี DNA เช่น [](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/product/sial/b2261) เทคนิคการย้อมสีโดยอ้อมของ Hoechs นั้นรวดเร็วพร้อมผลลัพธ์ที่มีอยู่ภายใน 72 ชั่วโมงซึ่งเปรียบเทียบได้ดีกับ [](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/cell-culture-and-cell-culture-analysis/cell-counting-and-health-analysis/mycoplasma-detection-and-elimination) การแยกวัฒนธรรม rmycoplasma 4 สัปดาห์ การย้อมสี o [fcell สาย](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/products/cell-culture-and-analysis/cell-lines-and-specialty-cell-culture/mammalian-cell-lines) ตรงกับคราบ DNA สามารถให้ผลลัพธ์ใน 24 ชั่วโมงอย่างไรก็ตามในความไวที่ลดลงมาก (~ 10 6 cfu/mL) ซึ่งอาจได้รับการปรับปรุงโดยการร่วมสร้างเส้นเซลล์ทดสอบในที่ที่มีเส้นเซลล์ตัวบ่งชี้เช่น Vero ขั้นตอนการเพิ่มปริมาณเชื้อนี้ส่งผลให้เกิดความไวต่อวัฒนธรรม 100 cfu/mL และเป็นวิธีที่ ECACC ใช้เป็นอันดับแรก ขั้นตอนนี้ยังช่วยเพิ่มความไวโดยการเพิ่มพื้นที่ผิวที่ mycoplasma สามารถติดได้ เช่นเดียวกับการตรวจจับโดยวัฒนธรรมวิธีการย้อมสี DNA เหมาะสำหรับการตรวจจับ mycoplasma จากวัฒนธรรมของเซลล์หรือตัวทำปฏิกิริยาเพาะเลี้ยงเซลล์ ## วัสดุ - [สื่อการเพาะเลี้ยงเซลล์](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/products/cell-culture-and-analysis/cell-culture-media-and-buffers): อุ่นเครื่องไว้ก่อนที่อุณหภูมิที่เหมาะสม (โปรดดูแผ่นข้อมูลสายเซลล์ ECACC สำหรับสื่อและอุณหภูมิที่ถูกต้อง) - เมทานอล ([322415](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/product/sial/322415)) - กรดอะซิติกน้ำแข็ง ([A6283)](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/product/sigald/a6283) - Hoechst 33342 สารละลายคราบ ([B2261)](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/product/sial/b2261) - เซลล์ตัวบ่งชี้เช่น Vero Cells ([84113001](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/product/sigma/cb_84113001)) *- Mycoplasma hyorhinis* NCTC10130 และ *- Mycoplasma orale* NCTC 10112 ## อุปกรณ์ - อุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคล (ถุงมือปลอดเชื้อ, เสื้อโค้ทในห้องปฏิบัติการ, หมวกนิรภัย) - Waterbath set to 37 °C - ตู้ความปลอดภัยทางจุลชีววิทยาของระดับการกักเก็บที่เหมาะสม - ชุดบ่มเชื้อ CO 2 ที่อุณหภูมิ 37°C - ไมโครสโคป (UV Epi-Fluorescence) - จานเพาะเชื้อเนื้อเยื่อ - หลายจาน 12 ดี - สไลด์ไมโครสโคปและภาพเต็ม 13 มม - อลูมิเนียมฟอยล์ ## ขั้นตอน ![ฮอยท์ไมคโคพลาสมา](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/microbiological-testing/mycoplasma-testing/hoechst-mycoplasmas.jpg "Microsoft Word - Protocol 10_Testing Cells for Mycoplasma Contamination by Indirect DNA Staining") 01. วางฝาครอบที่ปราศจากเชื้อในจานเพาะเชื้อ/จานเพาะเชื้อเช่นแผ่นกันกระแทก 12 แผ่น 02. เติมเซลล์ตัวบ่งชี้ 2 มล. ลงในจานที่เตรียมไว้เช่น 2 x 104 Vero Cells ต่อหลุม 12 แผ่นดี 03. บ่มเชื้อที่อุณหภูมิ 37°C ใน CO 5 2 10% เป็นเวลา 2-24 ชั่วโมงเพื่อให้เซลล์ยึดติดกับใบปะหน้า 04. นำสายเซลล์ทดสอบที่ติดอยู่ไปไว้ในระบบกันสะเทือนโดยใช้ตัวขูดเซลล์ สายเซลล์ระบบกันสะเทือนอาจได้รับการทดสอบโดยตรง 05. ลบ 1 มล. ของสารลอยตัวทางวัฒนธรรมจากหลุมที่ซ้ำกันและเพิ่ม 1 มล. ของตัวอย่างการทดสอบในแต่ละ ฉีดเชื้อ 2 หลุมด้วย 100 cfu ของแต่ละสิ่งมีชีวิตควบคุมบวก 06. ปล่อยให้หลุมวัฒนธรรมเนื้อเยื่อซ้ำกันไม่ได้ฉีดเป็นการควบคุมเชิงลบ 07. บ่มอาหารที่อุณหภูมิ 37°C ใน 5% CO2 เป็นเวลา 3-5 วัน 08. หลังจากผ่านไป 3-5 วันให้ยึดเซลล์ไว้ด้วยการเติม Carnoy’ s fixative อย่างน้อย 2 มล. (1:3 กรดอะซิติกน้ำแข็ง: เมทานอลสัมบูรณ์) ลงในแต่ละจานและทิ้งไว้ 3 นาที จากนั้นจึงเปลี่ยนเป็นขวดขยะที่เป็นพิษ ทำซ้ำอีกครั้ง เพิ่มอย่างน้อย 2 มล. รอยเปื้อน Hoechst 0.4μg/nl ทิ้งไว้ 3 นาทีเพื่อป้องกันแสงโดยตรงเช่นโดยการปิดด้วยอลูมิเนียมฟอยล์ 09. Decant ใช้และไม่ได้ใช้คราบเพื่อขยะพิษ 10. ใส่สารยึด 1 หยดลงในสไลด์ไมโครสโคปที่ติดฉลากไว้แล้วและวางโคเวอร์ลิป (ด้านเซลล์คว่ำลง) ลงบนสไลด์ 11. ปิดสไลด์ด้วยแผ่นอลูมิเนียมฟอยล์เพื่อให้สามารถตั้งค่าได้อย่างน้อย 15 นาทีที่อุณหภูมิ 37°C หรือ 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง 12. สังเกตสไลด์ใต้ UV Epi-Fluorescence ที่ 100 x __เกณฑ์สำหรับผลลัพธ์ที่ถูกต้อง__ การควบคุมเชิงลบไม่แสดงหลักฐานของการติดเชื้อ mycoplasma; การควบคุมเชิงบวกแสดงหลักฐานของการติดเชื้อ mycoplasma; เซลล์ Vero เห็นได้ชัดว่าเป็นนิวเคลียสเรืองแสง __เกณฑ์สำหรับผลลัพธ์ที่เป็นบวก__ ตัวอย่างที่ติดเชื้อ mycoplasma จะถูกมองว่าเป็นนิวเคลียสเรืองแสงบวกกับการเรืองแสงนิวเคลียร์พิเศษของดีเอ็นเอ mycoplasma (cocci ขนาดเล็กหรือเส้นใย) __เกณฑ์สำหรับผลลัพธ์ที่เป็นลบ__ ตัวอย่างที่ไม่ติดเชื้อจะถูกมองว่าเป็นนิวเคลียสเรืองแสงกับพื้นหลังสีเข้ม ไม่ควรมีหลักฐานของ mycoplasma เช่นการเรืองแสงนิวเคลียร์พิเศษของดีเอ็นเอ mycoplasma __หมายเหตุ__ 1. รอยเปื้อน DNA เช่นรอยเปื้อนของ Hoechst จะเชื่อมกับ DNA โดยเฉพาะ ในทุกวัฒนธรรมนิวเคลียสของเซลล์จะเรืองแสง ในทางทฤษฎีวัฒนธรรมที่ไม่มีการปนเปื้อนจะแสดงเฉพาะนิวเคลียสเรืองแสงในขณะที่วัฒนธรรมบวก mycoplasma มี cocci ขนาดเล็กหรือเส้นใยซึ่งอาจหรืออาจจะไม่ได้รับการดูดซับลงบนเซลล์ (__รูปที่ 11__) อย่างไรก็ตามโปรดทราบว่าดีเอ็นเอที่ไม่เกี่ยวข้องใดๆจะมีการเรืองแสงเช่นเศษเซลล์ - ซึ่งบางครั้งเข้าใจผิดว่ามีการปนเปื้อน mycoplasma 2. คราบ Hoechst เป็นพิษและควรได้รับการจัดการและทิ้งด้วยความระมัดระวัง 3. ในบางกรณีผลลัพธ์อาจตีความได้ยากด้วยเหตุผลต่อไปนี้: •การปนเปื้อนของแบคทีเรีย/ยีสต์/เชื้อรา •เศษวัสดุมากเกินไปในพื้นหลัง (เช่นในกรณีของสายเซลล์ไฮบริดจ์) •นิวเคลียสที่แตกเนื่องจากเซลล์ทั้งหมดตายแล้ว •เซลล์ที่มีชีวิตน้อยเกินไปหรือไม่มีเซลล์ 4. แม้ว่าขั้นตอนนี้จะแนะนำให้ใช้การควบคุมเชิงบวกแต่อาจไม่จำเป็นต้องเป็นไปได้หรือเป็นที่ต้องการในสถานที่เพาะเลี้ยงเซลล์ที่มีทรัพยากรจำกัด หากต้องใช้การควบคุมเชิงบวกควรดำเนินการในห้องปฏิบัติการแยกต่างหากจากสถานที่เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหลัก หากไม่ได้ใช้การควบคุมเชิงบวกขอแนะนำให้คุณใช้ห้องปฏิบัติการทดสอบอิสระเพื่อทดสอบสายเซลล์ของคุณเป็นระยะ 5. ECACC ขอแนะนำให้ทดสอบตัวอย่างสำหรับ mycoplasma โดยใช้วิธีการตรวจจับอย่างน้อยสองวิธี (เช่นการตรวจหารอยเปื้อน DNA ทางอ้อมและการแยกวัฒนธรรม) เพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่น่าเชื่อถือยิ่งขึ้น เนื่องจากความไวในการตรวจจับที่แตกต่างกันของวิธีการสำหรับ mycoplasma ชนิดต่างๆ ECACC มีบริการทดสอบ mycoplasma ซึ่งมีวิธีการตรวจจับที่แตกต่างกันสามวิธีได้แก่ PCR, คราบ DNA ทางอ้อมและการแยกวัฒนธรรม __บทความที่เกี่ยวข้อง__ - [Testing Cells for Mycoplasma Contamination by Culture Isolation](https://www.sigmaaldrich.com/TH/en/technical-documents/technical-article/microbiological-testing/mycoplasma-testing/testing-cells-for-mycoplasma) __หมวดหมู่สินค้าที่เกี่ยวข้อง__ - [อาหารเลี้ยงเซลล์ทั่วไปและบัฟเฟอร์](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/products/cell-culture-and-analysis/cell-culture-media-and-buffers/classical-media-and-buffers) - [สารบัฟเฟอร์ทางชีวภาพ](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/products/chemistry-and-biochemicals/biochemicals/biological-buffers) - [เซรั่มจากตัวอ่อนวัว (FBS)](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/products/cell-culture-and-analysis/cell-culture-supplements-and-reagents/fbs) - [กรดสำหรับใช้ในห้องปฏิบัติการ การวิเคราะห์ และการใช้งานตามข้อกำหนด](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/products/chemistry-and-biochemicals/lab-chemicals/acids) - [ตัวทำละลาย](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/products/analytical-chemistry/analytical-chromatography/solvents) บนสุด __เข้าสู่ระบบเพื่อดำเนินการต่อ__ เพื่ออ่านต่อ โปรดเข้าสู่ระบบหรือสร้างบัญชีใหม่ เข้าสู่ระบบ__ยังไม่มีบัญชีใช่หรือไม่?__ลงทะเบียน หน้านี้ได้ถูกแปลโดยเครื่องแปลภาษาเพื่อความสะดวกของลูกค้าของเรา เราได้พยายามเพื่อให้มั่นใจว่าเครื่องแปลภาษาแปลได้ถูกต้องแม่นยำ อย่างไรก็ตาม เครื่องแปลภาษานั้นไม่สมบูรณ์แบบ หากคุณไม่พอใจกับเนื้อหาที่แปลโดยเครื่องแปลภาษา โปรดอ้างอิงจากฉบับภาษาอังกฤษ An unknown error has occured.