Water for Next-Generation Sequencing

Estelle Riche, Stephane Mabic

Lab Water Solutions, Merck, Guyancourt, France

Nước được sử dụng trong suốt quy trình sắp xếp trình tự thế hệ tiếp theo (NGS), từ phân mảnh DNA đến chạy trình tự và làm sạch dụng cụ. Sử dụng chất lượng nước thích hợp cho mỗi bước sẽ không chỉ loại bỏ nguy cơ gây ô nhiễm nước can thiệp vào axit nucleic và nhiều phản ứng enzyme được thực hiện trong quá trình này, mà còn giúp ngăn ngừa ô nhiễm dụng cụ.

Giới thiệu về NGS

NGS đã cách mạng hóa nghiên cứu bộ gen, và hiện đang đóng một vai trò quan trọng trong môi trường lâm sàng. Các xét nghiệm dựa trên NGS là vô giá trong việc đánh giá các loại thuốc điều trị mới, và ngày càng được sử dụng để sàng lọc, chẩn đoán và đặc tính phân tử của ung thư và nhiều bệnh khác. Sự phát triển của các công cụ bệnh lý phân tử này dẫn đến cách chăm sóc cá nhân và y học phòng ngừa.^1,2 Phòng thí nghiệm tiến hành trình tự thông lượng cao dựa vào thuốc thử chất lượng cao để có kết quả tốt nhất. Nước là một thuốc thử thiết yếu nhưng thường bị bỏ qua trong quy trình làm việc của NGS. Từ hoạt động vệ sinh hệ thống đến chạy trình tự, các hoạt động khác nhau trong quy trình làm việc NGS yêu cầu các mức chất lượng nước khác nhau.

Làm quen với nhiều bước khác nhau trong quy trình làm việc của NGS

Các nền tảng NGS khác nhau có sẵn ngày nay dựa vào các chiến lược hóa học và trình tự khác nhau, nhưng hầu hết trong số chúng tuân theo quy trình tương tự (Hình 1). Chất lượng nước có thể ảnh hưởng đến từng bước của quy trình công việc này.

Hình 1. Quy trình làm việc NGS và các yêu cầu chất lượng nước cụ thể.

DNA Fragmentation

Các thư viện trình tự chất lượng cao rất quan trọng trong việc thu thập dữ liệu NGS đáng tin cậy³và bước đầu tiên quan trọng là phân mảnh DNA. Nếu sử dụng cắt xén âm thanh hoặc phát sóng âm để phân mảnh DNA, nước tinh khiết, không có hạt, (ví dụ như từ hệ thống Elix ®), được khuyến nghị cho bồn nước, vì tạp chất có thể gây ra sự thay đổi trong hiệu quả truyền năng lượng đến mẫu. Nước nên được thay đổi thường xuyên để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn và giảm nguy cơ nhiễm bẩn mẫu.

Nucleic Acid Library Preparation

Nước có thể chứa chất gây ô nhiễm, mặc dù với số lượng nhỏ, có thể trực tiếp can thiệp vào DNA và/hoặc các phản ứng enzyme được thực hiện trong quá trình chuẩn bị thư viện (ví dụ: Sửa chữa cuối, nối, PCR). Hoạt động của enzyme có thể bị ảnh hưởng bởi dấu vết của các phân tử hữu cơ (axit humic), và các ion hoặc kim loại (magiê, sắt, v.v.) có khả năng có trong nước. Ngoài ra, nuclease có thể làm suy giảm mẫu và nên tránh. Cuối cùng, các chất gây ô nhiễm nước như các hạt hoặc vi khuẩn có thể làm ô nhiễm dụng cụ hoặc lắng đọng vào các dòng của các bộ xử lý chất lỏng tự động. Do đó, nước siêu tinh khiết không có nuclease (ví dụ, từ hệ thống Milli-Q ® được trang bị  bộ đánh bóng siêu lọc Biopak ®) được khuyên dùng cho các bước này.

Để định lượng thư viện và kiểm soát chất lượng, điện di dựa trên chip hoặc mao mạch có thể được sử dụng. Trong tất cả các trường hợp, việc di chuyển mẫu tối ưu hóa đối với điện tích của nó phụ thuộc vào chất lượng nước và phát hiện huỳnh quang có thể bị gián đoạn bởi các chất ô nhiễm hữu cơ. Do đó, để đảm bảo kết quả đáng tin cậy, nước siêu tinh khiết không chứa ion và chất hữu cơ (điện trở 18,2 MOhm·cm; Mức carbon oxy hóa tổng cộng ở 5 ppb trở xuống) nên được sử dụng để chuẩn bị chất đệm và mao mạch và cho dịch pha loãng.

Giải trình tự thế hệ tiếp theo

Quá trình sắp xếp trình tự rất nhạy cảm với bất kỳ hoạt động nuclease nào. Mặc dù tác động của ô nhiễm nuclease có thể không rõ ràng trong giai đoạn tải và hiệu chỉnh ban đầu, theo thời gian, sự suy giảm tín hiệu có thể chứng minh thảm họa cho kết quả thí nghiệm. Vì lý do này, nước siêu tinh khiết không có nuclease được khuyến nghị cho các chất pha loãng đệm và bộ đệm chạy hệ thống.

• 
  Các nền tảng NGS dựa trên huỳnh quang khác nhau về kỹ thuật và trình tự hóa học, nhưng hầu hết trong số chúng dựa vào phát hiện huỳnh quang. Ngoài các chất gây ô nhiễm nước nói trên, phải tránh các dấu vết hữu cơ, vì chúng có thể ảnh hưởng đến huỳnh quang. Thật vậy, các chất ô nhiễm hữu cơ trong nước có thể làm nguội hoặc làm tăng tín hiệu huỳnh quang, dẫn đến kết quả sai trong cả hai trường hợp.
  
  
• Chất bán dẫn ion NGS
  Công nghệ trình tự này giám sát sự kết hợp của nucleotide bằng cách phát hiện các proton được phát hành.⁴ Việc phát hiện, thay vì quang học, do đó được thực hiện bằng các phép đo chính xác về sự thay đổi pH. Công nghệ này nhạy cảm với bất kỳ sự thay đổi pH nào không phải do sự mở rộng của phân tử DNA. Các nhà sản xuất dụng cụ đặc biệt khuyến nghị sử dụng nước siêu tinh khiết mới tinh chế để đảm bảo độ pH gần 7. Điều này là do thực tế là, khi lưu trữ tiếp xúc với khí quyển, nước siêu tinh khiết hấp thụ carbon dioxide và trở nên hơi có tính axit (Hình 2), ảnh hưởng đến quá trình sắp xếp trình tự. Vì lý do này, nước siêu tinh khiết phải được tinh chế và bảo vệ khỏi tiếp xúc với khí quyển khi nó được sử dụng cho chất bán dẫn ion NGS.

Hình 2. Hấp thụ carbon dioxide bằng nước siêu tinh khiết. Khi nước siêu tinh khiết tiếp xúc với khí quyển, nó hấp thụ carbon dioxide từ không khí, dẫn đến sản xuất axit cacbonic, cacbonat và bicarbonate. Độ pH của nước, ban đầu ở mức 7,0, có thể giảm xuống thấp tới 5,8.

Kết luận

Nước là một chất thử thiết yếu trong NGS và chất lượng của nó có tác động trực tiếp đến tính nhất quán và độ tin cậy của kết quả sắp xếp trình tự. Một hệ thống lọc nước được thiết kế tốt và bảo trì có thể cung cấp cho các phòng thí nghiệm nước chất lượng cao được điều chỉnh để đáp ứng tất cả các nhu cầu cụ thể của họ.

 

Sự công nhận

Các tác giả rất biết ơn Tiến sĩ Sean P. Kennedy, Trưởng phòng Biomics Pole, Viện Pasteur, Paris, Pháp vì sự hỗ trợ kỹ thuật và chuyên môn của ông.

Tài liệu tham khảo

1. Cree IA, Deans Z, Ligtenberg MJL, Normanno N, Edsjö A, Rouleau E, Solé F, Thunnissen E, Timens W, Schuuring E, et al. 2014. Guidance for laboratories performing molecular pathology for cancer patients. J Clin Pathol. 67(11):923-931. https://doi.org/10.1136/jclinpath-2014-202404

2. Harris TJR, McCormick F. 2010. The molecular pathology of cancer. Nat Rev Clin Oncol. 7(5):251-265. https://doi.org/10.1038/nrclinonc.2010.41

3. Head SR, Komori HK, LaMere SA, Whisenant T, Van Nieuwerburgh F, Salomon DR, Ordoukhanian P. Library construction for next-generation sequencing: Overviews and challenges. BioTechniques. 56(2): https://doi.org/10.2144/000114133

4. Mardis ER. 2013. Next-Generation Sequencing Platforms. Annual Rev. Anal. Chem.. 6(1):287-303. https://doi.org/10.1146/annurev-anchem-062012-092628