Fosfatase alcalina (FA)

A 37 °C com 4-nitrofenil fosfato como substrato e dietanolamina como tampão (400 U/mg a 25 °C com 4-nitrofenil fosfato como substrato e glicina como tampão)

Monoéster ortofosfórico de fosfoidrolase (alcalina ideal)
A fosfatase alcalina catalisa a remoção do grupo fosfato de vários compostos que são fosforilados.[1] Ela hidrolisa os grupos 5′-monofosfato tanto do DNA quanto do RNA. Também pode hidrolisar os grupos 5′-difosfato e 5′-trifosfato do RNA.

Clivagem seletiva de grupos fosfato terminais de oligonucleotídeos e na troca e liberação de nucleotídeos proteicos.[2][3] Também foi usado para fosforilar amostras para distinguir porções de fosfato presentes como glicanos fosforilados e resíduos de aminoácidos fosforilados.

Inativação térmica: A atividade da FA é destruída irreversivelmente pela incubação da enzima a 65 °C.
A desnaturação é dependente da concentração proteica - usando menos de 10 U/ml (0,1 mol/l de tampão de glicina, pH 10,5, 1 mmol/l de MgCl₂ e 0,1 mmol/l de ZnCl₂), a FA é inativada com uma incubação de 10 minutos a 65 °C.

Suspensão em solução de sulfato de amônio 3,2 M, MgCl₂ 1 mM, ZnCl₂ 0,1 mM, pH aproximadamente 7.

• Ativador: Íons metálicos bivalentes (Mg²⁺, Co²⁺, Mn²⁺)
• Amino-álcoois (2-amino-2-metil-1-propanol, dietanolamina)

Observe que altas concentrações de amino-álcoois também podem agir como inibidores competitivos (p. ex., monoetanolamina em dietanolamina).

Condições de armazenamento (solução de trabalho): A suspensão é fornecida em uma c= aprox. 5 mg/ml.
Se essa suspensão for diluída somente 5 a 10 vezes com uma outra solução de sulfato de amônio 3,2 M, MgCl₂ 1 mM, ZnCl₂ 0,1 mM, pH de aprox. 7, a experiência em geral nos levaria a esperar estabilidade de algumas semanas desde que armazenada a 4 °C (sem garantias!).

Contaminantes: <0,0004% de PDE, <0,004% de ADA e A-5-MP desaminase, cada

A FA é um dímero de subunidades idênticas ou quase idênticas; cada uma delas contém 2 moléculas de Zn²⁺, uma ligada fixamente e necessária para a estabilidade estrutural, a outra ligada de modo mais solto e necessária para a atividade catalítica. O sítio ativo contém uma serina reativa.
Em alguns mamíferos (p. ex., humanos), existem pelo menos 3 isoenzimas distinguíveis: a intestinal, placentária e a forma encontrada em ossos/intestino/rim.

Conversão de unidades: 1 unidade da Roche (testada a +25 °C) corresponde a aproximadamente 2 a 2,5 unidades da Sigma (testada a +37 °C).
A atividade da FA não é expressa em unidades Armstrong; não se conhece um fator de conversão para unidades internacionais.
Aprox. 3,8 U (FA de grau I) ou 4,0 U (FA de grau II) [+37 °C, 4-NPP como substrato, dietanolamina como tampão, pH 9,8] = 1 U [+25 °C, 4-NPP como substrato, glicina como tampão, pH 10,5].

Informações bioquímicas. 87 (FA de grau I) :
1,0 U [+37 °C, condições de ensaio de CQ] = 0,79 U [+30 °C, condições de ensaio de CQ] = 0,57 U [+25 °C, condições de ensaio de CQ]

Somente para fins de pesquisas biológicas. Não é destinado ao uso em procedimentos diagnósticos.