General description
L'MTT è un substrato giallo pallido che nelle cellule vive viene scisso con produzione del composto formazano, di colore blu scuro. Questo processo richiede la presenza di mitocondri attivi, subito dopo la morte infatti le cellule non sono più in grado di produrre quantità significative di MTT. Questo saggio colorimetrico può essere utilizzato per sia per l′analisi della proliferazione cellulare che come test di citotossicità mediata dal complemento.
Application
Protocollo:
1) Effettuare i saggi con linfochine e mitogeni o l′analisi della citotossicità complemento-mediata utilizzando i metodi standard, in piastre per colture tissutali a fondo piatto da 96 pozzetti e dotate di una buona qualità ottica (ad es. Falcon). Il volume finale del terreno di coltura in ciascun pozzetto deve essere di 0,1 ml e il terreno usato (ad es. RPMI o DMEM) può contenere fino al 10% di siero fetale bovino.
2) Alla fine dell'analisi aggiungere 0,01 ml di soluzione AB (MTT) a ciascun pozzetto. Mescolare picchiettando delicatamente sul bordo della piastra.
3) Incubare a 37°C per consentire la riduzione dell′MTT. Il tempo di incubazione ottimale varia da saggio saggio, nella maggior parte dei casi sono sufficienti quattro ore. Al termine dell′incubazione, il formazano prodotto nei pozzetti contenenti le cellule vive apparirà sotto forma di depositi di cristalli indistinti neri.
4) aggiungere 0.1 ml di isopropanolo con HCL 0.04 N ad ogni pozzetto. Miscelare accuratamente pipettando ripetutamente con una pipetta multicanale. L'HCl fa virare il rosso fenolo del terreno al giallo, un colore che non interferisce con la misurazione del formazano. L'isopropanolo dissolve il formazano, si ottiene così una soluzione blu omogenea, adatta per la misurazione dell'assorbanza.
L′assorbanza va misurata entro un′ora con un lettore di piastre per ELISA, a 570nm, usando una lunghezza d′onda di 630 nm come riferimento. Dopo alcune ore a temperatura ambiente, le proteine del siero potrebbero iniziare a precipitare a causa della presenza dell′acido/alcool. Il raffreddamento delle piastre ha l′effetto di accelerare la precipitazione. Nel caso la misurazione non venga fatta subito, mantenere le piastre a 4° C prima di aggiungere l'acido/alcool, quindi lasciarle riscaldare a temperatura ambiente e aggiungere l'acido/alcool appena prima della lettura.
Risultati:
normalmente il saggio MTT è in grado di rilevare 200-50,000 cellule di una comune linea cellulare anche se l'intervallo utile al test è compreso tra 1,000 e 50,000 cellule. Questo intervallo può variare a seconda del tipo di cellule in esame. I saggi di citotossicità devono essere settati in modo che il controllo (cellule non lisate) dia un segnale compreso tra 0,2 e 0,4 mentre nel caso dei saggi di proliferazione tale valore dovrebbe essere raggiunto alle concentrazioni di plateau. Nel caso di una comune linea cellulare ciò corrisponde a circa 20-50,000 cellule per pozzetto.
L'assorbanza è direttamente proporzionale al numero di cellule; le cellule di per se non assorbono in modo significativo, anche fino a concentrazioni di 1 x 106 cellule/ml.
Preparation Note
Mantenere a 2- 8°C per un massimo di sei mesi. La miscela Reagente A / Soluzione B è stabile a 2-8°C per un massimo di due settimane.
Preparazione del reagente:
aggiungere 10 ml di Soluzione B a una fiala di Reagente A. Mescolare bene, filtrare in condizioni sterili e conservare al buio a 4°C fino al momento dell′utilizzo. N.B.: Potrebbe richiedere molto tempo (anche tutta la notte) per dissolversi. Non scaldare la soluzione. Se fosse assolutamente necessario sciogliere i cristalli, regolare il pH con 1-2 gocce di HCl. In queste condizioni la miscela AB rimane stabile per diverse settimane.
Other Notes
Reagente A: MTT, (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro), 50 mg/provetta.
Soluzione B: PBS pH 7.4, 15 ml
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